鸡新城疫病毒感染性核酸免疫抗原、抗体和N基因的检测

少林寺

鸡新城疫病毒感染性核酸免疫抗原、抗体和N基因的检测
        摘 要：SDS-蛋白酶K法提取鸡新城疫病毒(NDV)，Lasota株鸡胚尿囊液毒纯化病毒的全基因组RNA，DEAE纤维素长距离柱层析纯化后，适量肌肉注射100日龄NDV非免疫鸡，24小时后口服过量的特异活性蛋白酶，于不同试验时间分别采取试验鸡血清和不同组织脏器，采用Dot－ELISA、Western blot和Southern blot方法分别检测试验鸡抗NDV抗体、NDV抗原和NDVN基因。结果表明，NDV感染性核酸注射后24小时，口服活性蛋白酶，48小时后出现NDV特异性抗体，96小时抗体达最高峰，Dot－ELISA血清抗体价可达1∶1 024；无活性蛋白酶情况下，感染性核酸注射后120小时开始出现NDV特异性抗体，Dot－ELISA血清价仅为1∶16；Western blot 和Southern blot分别可自多个组织脏器中检测到NDV抗原及N基因。
       关键词：鸡；新城疫病毒；感染性核酸；抗原；抗体；基因


       鸡新城疫仍为困扰养禽业发展的重要传染病之一，常规疫苗的免疫失败和大量中等毒力活疫苗的频繁使用造成强大的免疫压力，是新城疫难以控制的一个重要原因。在NDV的复制过程中，病毒首先吸附在细胞受体上，受HN多肽调解，由F蛋白完成病毒与细胞的融合，核衣壳复合物进入细胞。病毒复制完全发生在胞浆中，因NDV的RNA具有负极性，需要在病毒RNA指导的RNA聚合酶的作用下产生互补的正链，它相当于mRNA，并利用细胞的机制，翻译出病毒蛋白质和基因组。NDV F蛋白为无活性前体蛋白F0，必需分解成F1和F2两个亚单位后，方能引起宿主细胞融合和分解，而这种分解作用需要宿主本身的蛋白酶系统完成。为探讨体外给予的NDV全基因组RNA能否在某种特定的活性蛋白酶的作用下在机体内完成完整NDV粒子的合成和包装，特设计并进行本试验，通过对NDV抗体、抗原和N基因的检测进一步证实。
       1 材料与方法
       1.1 NDV Lasota鸡胚尿囊液毒、11日龄非免疫鸡胚和100日龄NDV非免疫鸡均由大连市家禽研究所提供。
       1.2 NDV阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。
       1.3 NDVN基因地高辛标记的核酸探针由兽医生物技术国家重点实验室曹殿军博士提供。
       1.4 按常规方法将NDV Lasota毒接种11日龄非免疫鸡胚绒毛尿囊腔，37 ℃培养48～72小时后收集鸡胚绒毛尿囊液。
       1.5 差速离心/密度梯度离心纯化病毒备用。
       1.6 SDS－蛋白酶K法提取病毒全基因组RNA。按常规方法处理RNA提取用的试剂、器皿等，以保证RNA的完整性。
       1.7 DEAE纤维素柱层析去除杂蛋白和RNA碎片。
       1.8 按经验试验量配置活性蛋白酶，保证本制剂经口服途径给予机体后，除胃蛋白酶消化的部分之外有足够的含量入机体细胞。
      1.9 按经验试验量肌肉注射适量NDV感染性核酸制剂，24小时后将试验鸡分成两组，每组30羽，一组口服活性蛋白酶，另一组作为对照。分别于试验后24、48、72、96、120、144小时采集试验和对照组鸡血清及肝、脾、肾、法氏囊等十多种组织脏器冻存备用。
1.10 按标准操作规程Dot－ELISA检测不同试验时间试验鸡及对照组鸡的血清抗体；Western blot检测试验组鸡不同脏器的NDV抗原；用地高辛标记的NDVN基因核酸探针Southern blot分子杂交检测试验组鸡不同脏器的NDVN基因。
      2 试验结果
      2.1 NDV感染性核酸进入机体后可产生互补的正链，并利用机体细胞的机制，翻译出病毒蛋白质和基因组，组装成完整的NDV粒子。感染性核酸进入机体后120小时可产生病毒特异的血清抗体，但抗体水平较低，Dot－ELISA检测抗体的水平仅有1∶16。
      2.2 体外给予适当的活性蛋白酶可加快NDV感染性核酸进入机体后产生互补的正链，利用机体细胞的机制翻译出病毒蛋白质和基因组并组装成完整的NDV粒子的速度；检测结果为NDV感染性核酸注射后24小时，口服活性蛋白酶，48小时后出现NDV特异性抗体，96小时抗体达最高峰，Dot－ELISA血清抗体价可达1∶1 024。
        2.3 Western blot和Southern blot的检测结果证明感染性核酸进入机体后24小时，在特定活性蛋白酶的作用下120小时之后可分别在多个组织脏器中检测到NDV抗原及N基因。
        2.4 Dot－ELISA、Western blot和Southern blot分别对NDV抗体、抗原和N基因的检测表明NDV感染性核酸完全可在机体内合成完整的病毒粒子。这种病毒粒子在特异活性蛋白酶的裂解作用下可迅速复制并刺激机体产生病毒特异的血清抗体。
        3 讨论
        与基因工程疫苗的研究思路截然不同，采用感染性基因组或cDNA预防和治疗家禽病毒性疾病将会是禽病防制领域又一新的研究天地。
       部分家禽病毒的基因组或其cDNA具有感染性，当这些感染性核酸进入机体之后，利用机体自身的整套酶系统，可以指导合成和包装成具有感染性核酸序列特异性的完整病毒粒子。这些完整的病毒粒子将具有天然病毒粒子相同的所有中和性抗原表位。因此分离并获得某些禽病弱毒病毒抗原的感染性基因组或其cDNA，由其在机体内指导合成和包装成完整的弱毒力病毒粒子将可与部分家禽弱毒疫苗同时使用，弥补现用弱毒疫苗的低免疫保护作用、免疫不全或免疫失败等，同时在机体患病状态下，这些感染性核酸的注入，由其指导合成的低毒力病毒粒子可诱导机体产生病毒特异的中和抗体，取到治疗病毒感染的作用。NDV基因组负极单股RNA为感染性核酸，当其进入机体后，在病毒RNA指导的RNA聚合酶、转录酶的作用下可产生互补的正链，由此翻译成病毒蛋白质和基因组，进而包装成完整的NDV粒子。完整的病毒粒子F蛋白作为无活性的前体蛋白F0，在宿主细胞的蛋白酶作用下，分解成F1和F2两个亚单位，引起宿主细胞的融合和分解，病毒粒子大量繁殖。如果用于研制感染性核酸的NDV是弱毒，这些大量繁殖的完整病毒粒子可起到弱毒疫苗的免疫预防或紧急治疗作用，若为强毒，则可引起机体发病。
        本研究的试验结果表明，选择适当的活性蛋白酶可促进NDV感染性核酸的复制与NDV的蛋白合成，这种状态下抗体形成高峰期为96小时，平均抗体水平为1∶1 024，较仅注射感染性核酸试验组平均抗体水平高64倍。
        江国托1,高房昌1,崔 丽1,兰措姐1,张海波1,康丽娟2,王丽云3,陈 瑶3,李文彬4,易 军5,王向阳5
        ( 1.大连三仪生物工程研究所,辽宁 大连 116036；2.大连市兽医卫生防疫站；3.辽宁省动物防疫站；4.大成食品大连有限公司；5.大连市科技局 )

问心无愧

你其实直接写结果就行