药敏实验？？？？

05790549

   问 一下 做药敏实验   需要哪些器具啊？？？希望大家不吝赐教 谢谢
还有怎么从鸡肝脏上提取细菌    谢谢了 ？？？？？

alfbin

恒温箱、定性滤纸、药敏板、天平、镊子、接种环。

鸡仙飘飘

简易药敏片的制作
一、因正规制作药敏片麻烦且使用起来不方便，主要是药量小看抑菌圈的大小也不好看。同时现在市场上的药都是复方药，厂家一般也不告诉诉客户配方，所以急需自制简易药敏片。今将制法奉送，不当之处，尚请斧正。
二、简易药敏片的制法
1、直接选用各药厂的（瓶装、袋装、筒装等）成品药来做。其它设备和器皿需要恒温箱、平皿（直径90mm或更大一点的都行）、烧杯、蒸馏水、滤纸、打孔器（这个东西去普通的文具店里就能买上，有两孔的有一个孔的），具体的操作步骤如下。
2、将蒸馏水加一定量到烧杯中，将要选的药厂的药直接加到烧杯中，边加边搅拌使它达到饱合状态（即再加药就不溶了为止）。加水量视做药敏片的多少而定，一般5毫升水就能做30~40个。一般情况下，水可以多一些。
3、将滤纸用打孔器打好小圆纸片。按需要做的量准备好小纸片的量。
4、将浇杯中的药液的上清液倒到干净干燥的平皿中。然后将小圆纸片逐片放入药水中，浸泡透即可，如果您所放的药敏片过多，也可多泡一段时间，如半个小时或一个小时，同时要翻动它们。
5、将浸泡好的药敏片用镊子夹出，放到另一干燥平皿中，注意药敏做的多时，放湿药敏片不要完全重叠地放。这样会使有的药敏片在干燥过程中所沾的药量不一，影响您对药的评价。因为有的药不溶，药厂会加一些助溶剂，干燥过程中有的药会析出。这时药敏片叠放位置会影响所沾的药量的。（所以有的药敏片在干燥时有药析出是正常的，不用着急）
6、将盛湿药敏片的平皿放到恒温箱中，温度37℃，放置12~24小时即可，不同的药干的时间也可能不一样，所以自己需要视情况而定。在这个过程中要注意勤翻一下药敏片，尽量不要让它们沾在一起。
7、要注意温度过高（60℃），药敏片颜色会深一些，甚至发黑。这时药敏片就不能用了。不过轻微发黄还是可用的。（有的药是黄的则另当别论）。
8、药敏片的储藏：短期使用可冷藏保存，长期保存要冷冻。使用时用几个拿几个，用后尽快将它们放回去。

鸡仙飘飘

兽医临床中的药敏试验
目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。因此，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。
一、什么是药敏试验？
      抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility test，AST），简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。
二、药敏试验的意义
    1、可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。是一种既经济又有效的方法。
    2、可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异。进行有效的药敏试验可以及时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。
    3、为临床用药提供参考依据。因为一个正确的药敏试验结果，可作为临床兽医和畜禽养殖者选用有效抗菌药的参考。长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。近十几年，在肉鸡生产中，为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，一些抗菌药物的盲目使用，导致耐药菌株越来越多。根据已进行的大量药敏试验结果，大肠杆菌、沙门氏菌对曾经敏感的氨基糖苷类、氟喹诺酮类等，均产生了不同程度的耐药性，经常发现对十几种常用抗菌药都不敏感的菌株。这是一个非常危险的信号。所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。

三、常用的药敏试验方法
     兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前牛津杯法和打孔法在兽医临床已较少应用。以下简单介绍纸片法。
1、药敏纸片的制作
   纸片法中使用的药敏纸片目前市场上已有较多厂家的产品销售。但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：
    取质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。按每张纸片饱和吸水量为0.01ml计，在上述含有50片纸片的小瓶内加入药液0.5ml，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30分钟即可。同时在记录药物名称，于37℃温箱过夜。在温箱或烘箱中的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。青霉素、金霉素宜在低温下真空干燥。干燥后即密封。切勿受潮，置阴暗干燥处或家用冰箱中保存，有效期4-6个月。
2、药液的制备
     自制药敏纸片时还需自行配制抗菌药液。抗菌药的稀释剂通常用蒸馏水。一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水浓度，按1g需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为：1g本品加5000ml蒸馏水。此溶液液即为用于做药敏试验的药液。
3、试验操作方法
     在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。然后用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5－6片。记住每种药敏纸片的名称。贴完纸片的平皿15分钟后再置于37℃温箱中培养16－24小时，观察记录结果。以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。
药敏试验结果判定标准
抑菌圈直径（毫米）敏感性
                     ＞20极敏感
                     15-20高敏感
                     10-14中敏感
                     ＜10低敏感
                     0不敏感
    实践证明，利用自制药敏纸片进行药敏试验，可以灵活选药，与某病菌相关的药物均可随时制作药敏纸片用于治疗。可在本场药品范围内或本地区容易买到的药品中选出最敏感的药物。还可在短时间内选择最佳药品和最佳剂量，既能缩短病程，又能避免盲目用药，减少浪费。
四、根据药敏试验选药原则
       完成药敏试验后，应根据结果选择敏感性较高，同时价廉、易得、安全的药物进行治疗，以减少耐药菌株，同时还应注意以下原则：
     1、在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。
      2、药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70－80%，所以也不能过分地依赖药敏试验。如发现疗效不显著应及时换药。
      3、药敏试验确定的首选药物不是一成不变。随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。
      4、窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。
5、避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。
四、影响药敏试验结果的因素
     在以纸片法进行药敏试验时，以下几方面因素可影响试验的结果：
      1、培养基：首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。其次，倾注平板时，厚度应合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
      2、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
       3、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
       4、培养时间：一般细菌培养温度和时间为37℃ 12-24小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。
五、药敏试验存在的问题
当前进行药敏试验仍然存在一些问题，主要包括以下几方面：
1、方法学不统一，没有标准化。
2、市场提供的药敏试验的培养基、药敏纸片等缺乏严格质控，质量难以保证。所以还是建议按要求自制药敏纸片。
3、因需要先进行细菌的分离培养，所以药敏试验报告出结果时间长，检验与临床缺乏沟通，对于基层兽医站或养殖场，药敏结果不能满足临床治疗要求，容易延误治疗时机。但根据有关报道，也可进行简易的药敏试验，方法如下：无菌取病死畜禽的部分肝、脾等组织，按1：5加生理盐水研磨制成悬液，静置5分钟，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5分钟后贴上药敏试纸，培养、观察抑菌圈大小。
  4、对于部分营养需求较高的细菌或微生物，如链球菌和支原体，临床上较难培养，限制了药敏试验的应用。
   5、部分养殖场或基层兽医站缺乏做细菌分离培养和药敏试验的意识。绝大多数养殖者或技术人员是在没有明确微生物学诊断的情况下使用抗菌药物，养殖场规模越小，细菌培养和药敏试验做的越少，有的养殖场轮翻使用多种抗菌药物而不做细菌培养和药敏试验，致使疗效不佳，治疗时机延误和药品的浪费。一些病例用药前不做药敏试验，而是在大量使用多种抗菌药物疗效不明显时才想起做细菌培养和药敏试验，而此时细菌已对多种抗菌药产生耐药性。
    自制药敏纸片
      　　近年来鸡大肠杆菌病严重威胁着家禽业的发展，给养殖户造成较大的经济损失。市场上治疗大肠杆菌病的药品繁多，其主要成分往往不写明，造成养禽户在发生疾病时用同一种成分、不同品名的药物替换使用，既增加损失，又延误病情。而自制药敏纸片就能减少这些损失。在测得药品对该菌的敏感程度后再用药，效果较好。
      　      　　一、病原
      　　禽大肠杆菌病原为埃希氏大肠杆菌，该菌系肠道正常菌群之　　一。但它有一些致病血清型，科研人员在大肠杆菌病鸡体内一般只能分离出某种特定血清型，比如O1、O2、O78、O35、O16等等。本菌呈多形性，有时接近球菌的形态，有时呈细长杆状或发丝状，但多数为两端钝圆，革兰氏染色阴性，中等大小的杆菌。
      　　      　　二、临床症状及病理变化
      　　      　　1.大肠杆菌病夏季较多见，雏鸡及体弱鸡易感，病鸡精神沉郁、腹泻，排出黄白色、绿色粪便，病鸡不喜走动，关节肿胀。败血型常引起呼吸道症状，产蛋鸡产蛋下降，砂皮蛋、白皮蛋增多，后期可见腹部胀大。在发生大肠杆菌病的鸡群中还发现个别鸡一侧或双侧眼失明和肿头现象。
      　　      　　2.剖检可见纤维素性浆膜炎。心外膜和心包膜上附着有多量灰白色纤维素性渗出物，气囊壁增厚，有黄白色干酪样渗出。肝脏有灰白色坏死点，有时肝表面形成一层纤维素性渗出物。经卵感染的雏鸡有卵黄囊炎，卵黄肿胀充血，其中充满棕色水样物；肉鸡关节红肿即滑膜炎，母鸡感染大肠杆菌病后在输卵管有干酪样渗出物，形成输卵管炎和腹膜炎，粘液型大肠杆菌常引起小肠、盲肠、肠系膜或肝脏出现肉芽肿。
      　　      　　三、细菌分离培养及鉴别
      　　      　　1.无菌采取新鲜病鸡心血，涂片，革兰氏染色镜检可见阴性中等杆菌。接种在普通琼脂培养基上培养18～24小时，形成圆形、湿润、半透明、隆起的乳白色中等大小菌落，挑取生长良好的菌落分别接种在伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯培养基和普通肉汤试管内，经37℃、培养18～24小时后观察。在伊红美蓝琼脂培养基上形成紫黑色带金属光泽的菌落，在麦康凯培养基上生长有圆形、边缘不齐、均匀一致的粉红色菌落，在普通肉汤试管内底部有黄白色絮样沉淀物，取肉汤内沉淀物镜检观察与剖检鸡的检出菌一致。
      　　      　　2.产气杆菌与大肠杆菌外观极相似。产气杆菌MR试验显阴性，VP试验显阳性，而大肠杆菌正相反。如果大肠杆菌接种在远滕氏培养基上则不能生长，产气杆菌则能生长。      　　      　
　四、药敏纸片的制做及用药、治疗原则
      　　      　　1.将滤纸用打孔器打成0.5cm直径的圆纸片。高压灭菌后干燥放置备用。将普通培养基制成平板，将营养肉汤培养的待试菌均匀涂布于平皿表面，将大肠杆菌的治疗药物按所用剂量10倍稀释，装于小瓶中，并注明品名、代号，取备用无菌纸片蘸取药液置于涂有细菌的平板上，37℃培养18～24小时观察敏感程度。选择敏感药物做为治疗药。中草药也可测试敏感程度，将中药研成粉未，按1:1加开水浸泡30分钟，过滤、高压灭菌后装入小瓶备用，试验方法同上。
      　　      　　2.在治疗过程中，药物最好现用现兑，以防效价降低，对败血型大肠杆菌病应选择药浓度高，药效持续长的药品。在实际工作中多采用中西结合方法(选择敏感中西药物联合使用)，效果极佳。
      　　      　　3.鸡大肠杆菌病易继发于其它疾病。即继发性大肠杆菌病。这就要“标”、“本”兼治，分清主次，正常家禽自然感染大肠杆菌病的机率很低，家禽只有在某些致病因素的作用下，机体抵抗力下降继发大肠杆菌病。例如，新城疫、支原体病、传染性法氏囊炎均易继发大肠杆菌病。一定要分清主次，找出病因之根本，这样才能彻底治愈。大肠杆菌是一种条件性致病菌，当疾病发生时除了对症治疗还应加强饲养管理，提高卫生条件，能起到很好的辅助治疗作用。
      　　
      　　五、病因分析及防制措施
      　　      　　1.饲养环境差、卫生条件不标准、水源不洁净、抗菌素的滥用、空气污染、各种应激、饲料变质、其它疾病的发生均系诱发大肠杆菌病的病因。
      　　      　　2.防制此病就应查找病因，对因防制。当鸡群流行其它传染病时，首先查其根本，追其先后，“标”、“本”兼治，这样才能有效地预防和治疗该病。
      　　      　　六、思考
      　　自制药敏纸片不仅对治疗大肠杆菌病有很好的作用，其它细菌引起的疾病也同样适用，凡是细菌培养中长势较好的细菌，均能做药敏试验。但应注意，当该疾病存在两种或两种以上的病原菌时，往往药敏结果有些差异，而中西结合用药能有效地减少这些情况的发生。预防重于治疗，这是养殖业中应始终遵循的原则。

盛凯养殖

看了好麻烦啊，有没有简单点方法

财神鸟

有视频的吗?!!!!!!!

不碎泡沫

试验很严谨的，别怕麻烦！！！！

孙李

有视频的吗?学习起来可以方便的

caishaobao

很好啊 学习了  
我现在也一直在做药敏试验及抗体检测试验

mawenli

病料直接涂抹可不可以  ，也就是我想省去培养病料菌群的时间 ，请高人指点

百草先生

说的很详细,辛苦了.谢谢!

hooooot

很棒的文章 值得学习