国产妥曲珠利对小鼠的急性毒性和亚慢性毒性试验

猪年

冯秀娟，郭永刚，王加才，江善祥[sup]*[/sup]

(南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095)   

摘　要：为了探讨妥曲珠利对小鼠的毒性作用，评价其临床用药危险性，进行了妥曲珠利对小鼠的急性毒性和亚慢性毒性试验。结果表明，妥曲珠利对小鼠无毒性作用，经口LD[sub]50[/sub]为5  011 mg/kg。妥曲珠利以500  、100、20  mg/kg给小鼠连续灌胃30  d，500  mg/kg表现出生长缓慢、肝脏损伤，100  mg/kg和20  mg/kg剂量组鼠的体重、脏器系数、血液指标均与空白对照组无差异(P>0.05)。表明妥曲珠利毒性小，临床推荐剂量是安全的。
关键词：妥曲珠利；急性毒性；亚慢性毒性；小鼠
妥曲珠利(Toltrazuril)属于三嗪酮类衍生物，是20世纪80年代德国拜耳公司研制成功的动物专用的一种高效的抗球虫药物。用于治疗和预防鸡、猪等动物球虫感染[sup][1][/sup]。由于进口妥曲珠利的价格高，进一步推广应用受到限制，为此南京农业大学动物医学院药理与毒理实验室与企业合作成功合成该药。妥曲珠利的分子式为C[sub]18[/sub]H[sub]14[/sub]F[sub]3[/sub]N[sub]3[/sub]O[sub]4[/sub]S，分子质量为425.4  u，熔点为194  ℃，不溶于水，溶于聚乙二醇、丙二醇等有机溶剂。本试验通过对国产妥曲珠利的急性毒性和亚慢性毒性研究，客观评价动物长时间接触该化合物的危害性，为临床用药提供理论基础。
1　材料与方法
1.1　药物
妥曲珠利原粉，由南京新兽药开发工程中心提供，含量99.8%。
1.2　实验动物
昆明种小鼠，清洁级，体重18  g～22  g，雌雄各半，南京中医药大学试验动物中心提供。
1.3　妥曲珠利药液的配制
使用时准确称取所需量的妥曲珠利原粉，加少量蒸馏水用研钵研磨后加蒸馏水溶解到所要求的浓度，制成妥曲珠利混悬液，采用灌服给药。
1.4　急性毒性试验
采用寇氏法计算LD[sub]50[/sub]。
1.4.1 100%致死剂量和0%致死剂量的确定　选择健康小鼠，采用灌胃方式给药，每组6只小鼠(雌雄各
半)，参照EMEA报道的妥曲珠利对小鼠的口服LD[sub]50[/sub]为5  000 mg/kg[sup][2][/sup]。在此数值基础上以500  mg/kg依次递增和递减，观察小鼠死亡情况。最后确定100%死亡剂量为12  500 mg/kg，0死亡剂量为2  500 mg/kg。
1.4.2　经口LD[sub]50[/sub]测定　取健康小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半，采取灌胃方式给药，染毒剂量分别为2  500、3 750、5  625、8 438、12  657 mg/kg，高低剂量比值为1.5。小鼠灌胃后观察7  d，记录各组别小鼠中毒症状、死亡时间及死亡数量，计算LD[sub]50[/sub]。
1.5　亚慢性毒性试验
1.5.1　试验分组与染毒剂量的确定　将小鼠随机分为4组，每组10只小鼠(雌雄各5只，雌雄小鼠分开饲养)，即妥曲珠利高、中、低3个剂量组和蒸馏水空白对照组，染毒剂量分别为LD[sub]50[/sub]的1/10、1/50、1/250。由急性毒性试验结果得到口服LD[sub]50[/sub]为5  011 mg/kg，因此妥曲珠利高、中、低3个剂量分别为500、100、20  mg/kg。
1.5.2　试验方法　采用30  d连续喂养试验，每天清晨每只小鼠灌胃相应剂量的妥曲珠利混悬液，空白对照灌胃相同体积的蒸馏水。
每天观察小鼠情况，记录死亡数，31  d时，称重计算各剂量组的体重变化；每个组分别取小鼠5只，眼眶采血，进行血常规检测(样品在南京解放军军区总医院测定)；小鼠处死，取主要脏器分别称重，计算脏器系数；主要脏器称重后，用100  mL/L福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色，进行病理组织学观察。
1.5.3　数据统计　数据用Microsoft Excel软件处理，处理后用SPSS软件进行ANOVA分析，数值用 X±SD表示。
2　结果
2.1　急性毒性试验结果
2.1.1　中毒症状　最高剂量组给药后5  h，小鼠开始出现不安，跳跃，呼吸急促，随后在几分钟内便死亡。其他剂量组小鼠仅见精神不振，反应迟钝，闭眼伏卧，不食等症状，随后在25  h～96  h出现个别死亡。剖检死亡小鼠各脏器，肉眼未见病理变化。
2.1.2　计算经口LD[sub]50[/sub]
2.1.2.1　试验小鼠中毒死亡情况见表1。   

表1　试验小鼠死亡率

Table 1 The mortality of mice given  toltrazuril

  

剂量（mg/Kg）                  Dosage(mg/Kg)	不同时间死亡只数                   The mumber of death in differ time				总死亡数（只）                   Death total mice counts	死亡率（％）mortality(%)
	1～24                   （h）	25～48（h）	49～72（h）	73～96（h）
2500	0	0	0	0	0	0
3750	0	1	2	0	3	30
5625	0	2	3	1	6	60
8438	0	3	2	3	8	80
12657	10	0	0	0	10	100

由表1可以看出，最大剂量小鼠死亡时间主要集中在给药后1  h～24  h内，各剂量给药96  h后小鼠停止死亡。死亡率与剂量成正相关性，出现0%和100%死亡率。
2.1.2.2　经口LD[sub]50[/sub]计算　采用改良寇氏公式计算，公式如下：
LD[sub]50[/sub]＝log[sup]－1[/sup][X[sub]m[/sub]－d(∑P－0.5)]   
计算可得：
LD[sub]50[/sub]＝5  011 mg/kg，根据经口LD[sub]50[/sub]分级标准[sup][3][/sup]，妥曲珠利为实际无毒药物。
LD[sub]50[/sub]的95%可信限＝log[sup]－1[/sup](logLD[sub]50[/sub]±1.96×SlogLD[sub]50[/sub])  
计算可得：
LD[sub]50[/sub]95%可信限：3  715 mg/kg～6  761 mg/kg  
2.2　亚慢性毒性试验结果
2.2.1　死亡率及各剂量组相对增重率　口服妥曲珠利后，最高剂量组在试验进行第25天时，少数小鼠出现行动迟缓，精神沉郁，之后死亡(在夜间)，其他小鼠反应灵敏，行为、活动正常，被毛有光泽，与空白对照无明显并异(表2)。

表2　第31天时各剂量组的死亡率和相对增重率

Table 2 Mortality and relative  weight gain of  mice on  31 st   

  

组别                   group		高剂量                   High         dose	中剂量                   Medium         dose	低剂量                   Low         dose	空白对照                   Cortrol         group
死亡率（％）                   Mortality(%)	20		0	0	0
相对增重率（％）                   relatively         weighting percentage (%)		99.93	111.25	100.96	100.00

  从表2可以看出，500  mg/kg剂量组，出现死亡率为20%，增重较空白对照组低；100  mg/kg和20  mg/kg剂量组未出现死亡，体重增加较空白对照组高。
2.2.2　第31天时各组小鼠的血常规指标　结果见表3。   

表3　小鼠血常规结果

Table 3 Blood routine of mice   

  

指标         index                  组别         group		白细胞                   WBC                   （×10[sup]9[/sup]个/L)	红细胞                   RBC                   (×10[sup]12[/sup]个/L)	血红蛋白                  hemoglobin                            （g/L）	红细胞压积                   packed         cellvolume                   （L/L）	血小板                   blood         platelet                   (×10[sup]9[/sup]个/L)
高剂量                  High         dose	7.28±3.41[sup]a[/sup]		8.92±0.68	146.8±11.78[sup] [/sup]	0.53±0.77[sup] [/sup]	770.2±113.89[sup] [/sup]
中剂量                  Medium         dose	5.68±2.67[sup]         ab[/sup]		8.56±0.49[sup] [/sup]	142.5±11.15	0.48±0.085[sup] [/sup]	842.25±131.13[sup] [/sup]
低剂量                  Low         dose	5.66±1.36[sup]         ab[/sup]		8.35±0.42[sup] [/sup]	142.2±7.25[sup] [/sup]	0.44±0.019[sup] [/sup]	818.80±69.76
空白对照                  Cortrol         group	3.90±1.79[sup]         b[/sup]		8.43±0.94[sup] [/sup]	129.4±34.65[sup] [/sup]	0.47±0.060[sup] [/sup]	949.20±249.24[sup] [/sup]

   
注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note：The different small letters in the same column stand for significant difference(P<0.05).
   
由表3可以看出，WBC个数用药组高于空白对照组，其中高剂量组显著高于空白对照组(P<0.05)，中、低剂量组与空白对照组差异不显著(P>0.05)；其他血液指标与空白对照组相比无明显变化。
2.2.3　第31天时各剂量组小鼠的脏器系数　结果见表4。   

表4　妥曲珠利对小鼠脏器系数的影响

Table 4 The effect of toltrazuril on  coefficients of  viscera of mice    

  

系数index                  组别         group	心脏                   heart	肝脏                   liver	肺脏                   lung	肾脏                   kidney	脾脏                   spleen
高剂量                   High         dose	0.0050±0.04	0.0660±1.66[sup] a[/sup]	0.0074±0.11	0.0148±0.49	0.0035±0.15
中剂量                   Medium         dose	0.0057±0.09	0.0570±0.90[sup] ab[/sup]	0.0088±0.20	0.0129±0.29	0.0058±0.11
低剂量                   Low         dose	0.0056±0.06	0.0560±0.54[sup] ab[/sup]	0.0077±0.20	0.0179±0.21	0.0052±0.19
空白对照                   cortrol	0.0051±0.09	0.0520±0.49[sup] b[/sup]	0.0092±0.29	0.0168±0.47	0.0046±0.09[sup] [/sup]

  注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note：The different small letters in the same column stand for significant difference(P<0.05).
  
由表4可以看出，高剂量组肝脏系数明显高于空白对照组(P<0.05)，其余脏器系数与空白对照组相比较，没有明显变化。中、低剂量组各脏器系数与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。
2.2.4　病理组织切片观察　高剂量组肝脏组织切片中肝小叶周围肝细胞发生明显的空泡变性，中央静脉充满红细胞；心肌血管中充满红细胞，部分心肌细胞萎缩；肺脏血管中充满红细胞；肾脏血管中充满血细胞。表明高剂量组对肝脏有损伤。其他剂量组未观察到明显的组织病理学变化。
3　讨论
3.1  急性毒性所采用的改良寇氏法是由顾汉颐在1958年提出的，此方法计算简便，但是必须有0%和100%的死亡率，是计算外源化合物半数致死量最常用的方法。本试验得出国产妥曲珠利对小鼠经口LD[sub]50[/sub]为5 011 mg/kg，LD[sub]50[/sub]的95%可信限为3 715 mg/kg～6 761 mg/kg；与EMEA报道[sup][2][/sup]妥曲珠利对小鼠的口服LD[sub]50[/sub]是5 000 mg/kg的结果相似。
3.2　妥曲珠利对小鼠机体的影响
妥曲珠利按照500 mg/kg灌服30 d，相对增重率低于100%，推测其原因可能是引起小鼠的胃肠炎症，影响饲料消化和吸收，同时肝脏发生空泡变性使物质代谢受到影响，从而影响体重增长；WBC数明显上升，出现炎性反应，可以进一步验证，妥曲珠利长期服用刺激消化道，引起小鼠胃肠炎症；通过脏器系数和病理切片来看，肝脏肿大，肝脏肝小叶周围肝细胞发生空泡变性，表明对肝脏有损伤。EMEA报道[sup][2][/sup]大鼠的90 d口服亚慢性毒性试验，妥曲珠利按照240 mg/kg日粮饲喂，增重和每天摄食量明显降低，轻微的影响了血液参数，干扰了肝脏功能，与本次试验结果相同。
本试验中妥曲珠利100 mg/kg和20 mg/kg灌服30 d，未见毒性反应，有增重作用。有的学者把这种现象称之为Hormesis现象[sup][4][/sup]，即为潜在低水平有毒物质产生的刺激效应，有些外源化合物其染毒剂量低于LD[sub]50[/sub]剂量时，会在观察期间发现动物体重反而增长加快，其增长率高于对照组的现象；另一种可能的原因是妥曲珠利在低剂量时具有促生长的作用。对于出现这种现象的原因尚待进一步研究和探讨。
本试验证明妥曲珠利对小鼠毒性较低，但是长期大剂量服用具有一定的慢性毒性作用，其慢性毒性的靶器官是肝脏，组织病理学变化主要是肝脏细胞发生空泡变性，但是并没有引起小鼠死亡。妥曲珠利对肝脏功能影响的机理有待进一步研究。妥曲珠利采用100 mg/kg剂量给药，未观察到毒性作用，暂定此剂量为无作用剂量，临床用药剂量不应超过此剂量。由于妥曲珠利临床应用药物剂量较100 mg/kg小的多，用药时间也较短。因此，初步判定妥曲珠利在临床上用药是安全的。


参考文献（略）

大鸡大利千寻

很好的教学材料，看这样的东西才有进步。。