【家禽细菌病】候鸟是多重耐药肠炎沙门氏菌与大肠杆菌传播至肉鸡养殖场的重要风险因素

共享精神

Tawakol MM, Nabil NM, Samir A, Hassan HM, Reda RM, Abdelaziz O, Hagag S, Elsayed MM. Role of migratory birds as a risk factor for the transmission of multidrug resistant Salmonella enterica and Escherichia coli to broiler poultry farms and its surrounding environment. BMC Res Notes. 2024 Oct 17;17(1):314.


多重耐药性（Multidrug resistance, MDR）目前被认为是全球家禽养殖业面临的重大危机 。在候鸟的迁徙路线中，它们在传播抗微生物耐药性病原体（尤其是向家禽养殖场传播）方面扮演着极其重要的角色 。本综述基于一项为期五年（2019年至2023年冬季）的深度实证研究，分析了从候鸟、肉鸡养殖场及其周边环境中采集的1050份样本（其中候鸟样本750份，肉鸡及环境样本300份）。研究重点在于分离肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）和大肠杆菌（Escherichia coli），并对其抗微生物耐药性（表型和基因型）进行检测，同时通过ERIC-PCR技术探究了候鸟与肉鸡养殖场分离株之间的遗传相似性 。研究结果表明，超过91%的沙门氏菌和大肠杆菌分离株具有多重耐药性，且两者在候鸟与家禽养殖场中存在高度的基因同源性，凸显了对候鸟实施持续监测计划以及在家禽养殖场实施严格生物安全措施的紧迫性 。

01引言与研究背景

在涵盖中东、北非和地中海盆地的广大区域中，埃及是人口密度较高的国家之一 。鸟类迁徙是自然界最伟大的未解之谜和奇观之一，而埃及与中东正处于全球主要候鸟迁徙路径的中心地带 。候鸟在迁徙过程中，能够通过共享环境、直接接触以及粪便排泄，将沙门氏菌传播给人类，同时也极易将其传播给家禽 。这不仅会导致人类和动物的疾病，还给家禽养殖业带来巨大的经济损失 (Dhama, 2008) 。

在候鸟迁徙期间，携带潜在致病性抗微生物耐药性细菌（包括产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌和多重耐药非伤寒沙门氏菌）对生态环境及病原传播产生了深远影响 (Islam, 2022; Card, 2023) 。沙门氏菌病是家禽业面临的最严峻问题之一，感染鸡只会出现脱水、腹泻、体重下降、关节炎、肺炎及脐炎等症状 (Shalaby, 2022) 。尽管部分大肠杆菌可作为益生菌保护宿主免受其他有害细菌侵害，但一旦其从其他微生物获得特定遗传物质，便可转化为致病菌 。禽致病性大肠杆菌是导致家禽大肠杆菌病的主要原因，其致死率可达30%，对埃及乃至全球的家禽养殖业构成了严重威胁 。

抗微生物药物耐药性（AMR）是全球关注的严重健康问题 。在家禽业中，由于频繁使用抗微生物药物进行治疗或将其作为促生长剂，家禽已成为多重耐药人畜共患细菌的重要宿主 (Moawad, 2018) 。因此，本研究的核心目的在于明确候鸟在将沙门氏菌和大肠杆菌传播至肉鸡养殖场中所起的作用，并对其耐药模式及遗传多样性进行深入探讨 。

02材料与方法

2.1 样本采集

本研究聚焦于埃及北部三角洲的三个省份（Dakahlia, Damietta 和 Port Said）。采样工作从2019年开始，连续进行了5年直至2023年，每年的采样集中在10月至次年2月的冬季迁徙期 。

共计收集了1050份样本，包括：

候鸟样本（750份）：每年收集150只在肉鸡养殖场附近或活禽市场中发现的候鸟（每个省份50只）。样本主要为候鸟的泄殖腔拭子，并对候鸟进行了标记和拍照以确定其英文和科学名称 。此外还收集了鸟类市场的笼子及周围环境拭子。所有拭子均使用无菌棉签在预先用2毫升缓冲蛋白胨水（BPW）湿润的条件下采集 。

肉鸡养殖场样本（300份）：每年从60个养殖场（每个省份20个）采集25-40日龄的患病肉鸡 。在无菌条件下对肉鸡进行临床和剖检（PM）检查，采集内部器官（肝、脾、盲肠、心脏和肺），取约4立方厘米的组织混合放入20 mL BPW中，对每只鸡的样本使用均质器处理30秒 。


2.2 细菌学检验

采集的样本用于分离和鉴定沙门氏菌与大肠杆菌 。

沙门氏菌：使用木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂平板进行分离，并根据ISO 6579进行生化鉴定 。随后根据Kauffman White方案使用沙门氏菌抗血清测定体壁（O）和鞭毛（H）抗原 。

大肠杆菌：使用伊红美蓝（EMB）琼脂平板进行分离和生化鉴定 。确认后使用大肠杆菌快速诊断抗血清试剂盒进行血清学鉴定 。


2.3 抗微生物药物敏感性测试

依据临床实验室标准指南（CLSI），采用纸片扩散法在Mueller-Hinton琼脂上进行体外药敏测试 。测试选用了属于8个不同类别的12种抗生素纸片：喹诺酮类（萘啶酸 NA、环丙沙星 CP、左氧氟沙星 L）、四环素类（四环素 T）、青霉素类（氨苄西林 AM）、磺胺类（磺胺甲恶唑 SXT）、林可酰胺类（克林霉素 CL）、氨基糖苷类（庆大霉素 G、阿米卡星 AK、卡那霉素 K）、头孢菌素类（头孢噻肟 CF）和大环内酯类（红霉素 E）。对三种或三种以上抗菌类别具有耐药性的菌株被定义为多重耐药（MDR）菌株 。

2.4 耐药基因的分子检测与遗传多样性分析

采用常规聚合酶链反应（PCR）技术检测表现出耐药性的菌株中最常见的五种抗微生物药物（磺胺甲恶唑、四环素、红霉素、氨苄西林和萘啶酸）的耐药基因（分别对应sul1,tetA (A),ereA,blaTEM和qnrA）。随后，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳并在紫外光下进行检测和拍照 。

选取4种常见的沙门氏菌血清型和7种常见的大肠杆菌血清群进行ERIC-PCR（肠道重复序列间一致性PCR）检测，以确定相同血清型之间的相似性 。数据转换为二进制代码后，利用UPGMA方法和Ward氏层次聚类程序生成树状图，并使用SPSS版本22进行聚类分析 。

03结果分析

3.1 肠杆菌科细菌的流行率与分离

总体而言，从候鸟和家禽养殖场中共分离出298株（28.4%）肠炎沙门氏菌，属于27个血清型 。这27种血清型包括：鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium, n=88）、肠炎沙门氏菌（S. Enteritidis, n=82）、肯塔基沙门氏菌（S. Kentucky, n=45）、S. Shangani (n=15) 等 。其中，鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌和 S. Shangani 是候鸟和家禽农场之间共享的4种常见血清型 。

同时，共分离出489株（46.6%）大肠杆菌，属于24个血清群，包括O1, O2, O103, O124, O125, O128, O26, O55, O91, O78等 。其中，候鸟样本中分离出244株，农场分离出255株 。

除沙门氏菌和大肠杆菌外，还记录了其他七个属的肠杆菌科细菌：柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、普罗威登斯菌属、沙雷菌属和哈夫尼亚菌属（Hafnia）。

表格 1：候鸟和肉鸡养殖场肠杆菌科分离株的流行率


3.2 血清学鉴定结果

血清分型结果显示，鼠伤寒沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌和肠炎沙门氏菌是从候鸟和农场分离出的最主要血清型 。对于大肠杆菌，O91、O26 和 O128 是最主要的三种血清群，而七个血清群（O91, O128, O26, O125, O55, O103 和 O159）是共同血清群 。

表格 2：分离的沙门氏菌血清型在候鸟和肉鸡农场中的流行情况



表格 3：分离的大肠杆菌血清群在候鸟和肉鸡农场中的流行情况





3.3 体外抗菌敏感性测试

分离出的沙门氏菌和大肠杆菌在针对8个类别的12种抗生素进行测试时，表现出了极高的耐药水平 。

在候鸟来源的沙门氏菌中，对萘啶酸的耐药率高达100%，四环素（31%-100%），氨苄西林（46.9%-100%），磺胺甲恶唑（68.8%-100%）和红霉素（87.5%-100%）也呈现出高耐药性 。肉鸡农场的沙门氏菌同样对萘啶酸表现出100%的耐药率，红霉素耐药率在92.6%至100%之间 。

绝大多数沙门氏菌（91.6%；298株中的274株）和大肠杆菌（92%；489株中的450株）表现出多重耐药性（MDR）。

表格 4：从候鸟和肉鸡农场分离的沙门氏菌的抗菌耐药模式

表格 5：分离的大肠杆菌的抗菌耐药流行情况

(此表展示了各年度分离的大肠杆菌对不同抗生素的耐药情况，结构与表4类似，原数据列举了NA, CP, L, T, AM, SXT, CL, G, AK, K, CF, E的耐药率，详细数据表明红霉素E和萘啶酸NA的耐药率均常年接近或达到100%)




3.4 耐药基因与基因组多样性

基因检测证实了表型分析结果。从候鸟分离出的耐药沙门氏菌中，sul1,tetA (A),blaTEM,ereA和qnrA基因的阳性率分别为96.7%, 82%, 41.3%, 94.7% 和 96.3%；而在肉鸡农场的沙门氏菌中，这些基因的流行率分别为96.7%, 95.6%, 46.8%, 97.6% 和 98.4% 。

表格 6：分离株中耐药基因的流行率和分布


ERIC-PCR指纹图谱生成了二叉树状图与热图（Heatmap），明确揭示了候鸟分离株与农场分离株之间的高度遗传一致性 。28株大肠杆菌和16株沙门氏菌产生的条带证实，两个不同来源的细菌在分子分型上可聚类于相同的组内，反映了它们极高的基因组连通性 。

04讨论与结论

本研究在长达五年的时间跨度内，详细记录了埃及北部地区沙门氏菌和大肠杆菌在候鸟与家禽养殖场中的高度流行。文献表明，沙门氏菌在埃及候鸟中的检出率曾被报道为28.26% (Shalaby, 2022)，在孟加拉国为21.21% 。本研究家禽养殖场中高达46.7%的沙门氏菌分离率，也与以往埃及当地学者的数据（32.6%）相吻合 。对于大肠杆菌，本研究中候鸟的检出率在不同年份达到22.7%至40.7%之间，与亚洲地区此前的研究（如34.7%）有相似性 。此外，在德克萨斯州收集的候鸟中，也有学者发现大肠杆菌的踪迹 (Callaway, 2014) 。

在耐药性方面，大部分从候鸟及养殖场分离出的细菌表现出对萘啶酸、环丙沙星、四环素、氨苄西林、磺胺甲恶唑、克林霉素和红霉素的高耐药率。这与 (Card, 2023) 等人的研究相符 。在发展中国家，抗生素（尤其是喹诺酮类药物）的滥用，将其用于非特异性治疗、亚治疗剂量预防甚至作为生长促进剂，极大地助长了细菌抗生素耐药性的产生 (Kamboh, 2018) 。关于农场沙门氏菌的耐药情况，本研究的发现与 (Shalaby, 2022) 的记录高度一致，后者也记录了对氨苄西林和红霉素的完全耐药性。而在分子层面，本研究检测到了高频出现的耐药基因（如blaTEM基因等），这进一步呼应了 (Sharif, 2020) 在野生候鸟肠炎沙门氏菌中检测到100% TEM基因的报告 ，以及 (Alam, 2020) 关于沙门氏菌中tetA基因高普遍性的研究 。(Yapicier, 2022) 和 (Islam, 2022) 同样在不同国家的野鸟分离株中发现了类似的高频率tet(A)和blaTEM基因表达 。

结论：ERIC-PCR分析和热图清晰地揭示了从候鸟和肉鸡农场分离的MDR大肠杆菌及沙门氏菌菌株之间存在的明显遗传相似性 。这一关键发现有力地证实了候鸟作为媒介，在将多重耐药性病原体（沙门氏菌和大肠杆菌）传播至家禽养殖场这一路径中扮演着不容忽视的潜在角色 。这一严峻的流行病学现实凸显了将候鸟纳入持续性抗菌监测计划的必要性，并强烈建议家禽养殖场应当实行更为严格的生物安全防范措施，从物理和生态链层面阻断候鸟进入或污染家禽生产环节的可能性 。

05原文图释


图 1：具有代表性的大肠杆菌 (泳道: 1–10) 和沙门氏菌 (泳道: 11–20) 分离株在基因组DNA中检测Tet A基因 (570 bp) 的PCR产物全长琼脂糖凝胶电泳图。泳道 L: DNA marker, P: 阳性对照, N: 阴性对照。泳道 2至5 为家禽养殖场中发现的候鸟的大肠杆菌阳性分离株。泳道 6至10 为活禽市场候鸟的大肠杆菌阳性分离株。泳道 11至15 为家禽养殖场候鸟的沙门氏菌阳性分离株。泳道 16至20 为活禽市场候鸟的沙门氏菌阳性分离株。


图 2：具有代表性的大肠杆菌 (泳道: 1–10) 和沙门氏菌 (泳道: 11–20) 分离株在基因组DNA中检测Sul 1基因 (433 bp) 的PCR产物全长琼脂糖凝胶电泳图。泳道 L: DNA marker, P: 阳性对照, N: 阴性对照。除泳道4外，泳道 1至5 均为家禽养殖场中发现的候鸟的大肠杆菌阳性分离株。泳道 6至10 为活禽市场中发现的候鸟的大肠杆菌阳性分离株。泳道 12至15 为家禽养殖场候鸟的沙门氏菌阳性分离株。泳道 16至20 为活禽市场候鸟的沙门氏菌阳性分离株。


图 3：具有代表性的大肠杆菌 (泳道: 1–10) 和沙门氏菌 (泳道: 11–20) 分离株在基因组DNA中检测qnrA基因 (516 bp) 的PCR产物全长琼脂糖凝胶电泳图。泳道 L: DNA marker, P: 阳性对照, N: 阴性对照。泳道 1至5 为家禽养殖场中发现的候鸟的大肠杆菌阳性分离株。泳道 6至10 为活禽市场中发现的候鸟的大肠杆菌阳性分离株。泳道 11至15 为家禽养殖场候鸟的沙门氏菌阳性分离株。泳道 16至20 为活禽市场候鸟的沙门氏菌阳性分离株。


图 4：具有代表性的大肠杆菌 (泳道: 1–10) 和沙门氏菌 (泳道: 11–20) 分离株在基因组DNA中检测ereA基因 (420 bp) 的PCR产物全长琼脂糖凝胶电泳图。泳道 L: DNA marker, P: 阳性对照, N: 阴性对照。泳道 1和3 为家禽养殖场候鸟的大肠杆菌阳性分离株。泳道 7和10 为活禽市场候鸟的大肠杆菌阳性分离株。泳道 13 为家禽养殖场候鸟的沙门氏菌阳性分离株。泳道 16和17 为活禽市场候鸟的沙门氏菌阳性分离株。


图 5：具有代表性的大肠杆菌 (泳道: 1–10) 和沙门氏菌 (泳道: 11–20) 分离株在基因组DNA中检测blaTEM基因 (516 bp) 的PCR产物全长琼脂糖凝胶电泳图。泳道 L: DNA marker, P: 阳性对照, N: 阴性对照。泳道 1至5 为家禽养殖场中发现的候鸟的大肠杆菌阳性分离株。泳道 6和10 为活禽市场候鸟的大肠杆菌阳性分离株。泳道 11至15 为家禽养殖场候鸟的沙门氏菌阳性分离株。泳道 16和20 为活禽市场候鸟的沙门氏菌阳性分离株。


图 6：28株大肠杆菌的PCR产物凝胶电泳图，产生1-4条大小在2000至2950 bp之间的条带。泳道：1–10, 14, 16, 23, 24, 26 和 27 来自农场；泳道：11–13, 15, 17–22, 25 和 28 来自候鸟。


图 7：16株沙门氏菌DNA片段的电泳图谱，产生5-8条大小在100至2974 bp之间的条带。泳道：1, 3, 4, 6, 8–12 & 16 来自农场；泳道：2, 5, 7 & 13–15 来自候鸟。


图 8：基于ERIC-PCR指纹图谱生成的树状图，代表了分离自候鸟的大肠杆菌（分离株ID 22, 19, 25, 28, 17, 15, 11, 12, 13, 18, 20 & 21；标为红色）与分离自肉鸡农场的大肠杆菌（分离株ID 23, 1, 24, 27, 16, 26, 8, 4, 5, 6, 7, 14, 2, 3, 9 & 10；标为绿色）之间的遗传关系。共展示了以A-J表示的11个ERIC谱型以及1-28号分离株ID。


图 9：基于ERIC-PCR指纹图谱生成的树状图，代表了分离自候鸟的沙门氏菌（分离株ID 7, 5, 13, 14, 15 & 2；标为红色）与分离自肉鸡农场的沙门氏菌（分离株ID 4, 6, 3, 1, 12, 11, 16, 9, 10 & 8；标为绿色）之间的遗传关系。包含了由A-N表示的14个ERIC谱型以及1-16号分离株ID。


图 10：选取从候鸟和肉鸡农场分离的肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌和婴儿沙门氏菌（最重要的致病菌株）以构建热图。聚类结果显示，从候鸟和肉鸡农场分离出占主导地位的多重耐药菌株具有相似性。


图 11：选取从候鸟和肉鸡农场分离的大肠杆菌O1、O26和O78（最重要的致病血清群）以构建热图。聚类结果同样展示了从候鸟和肉鸡农场分离的主流多重耐药菌株存在强相关性。

来源：菌中无戏言，作者：凤凰于飞