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2,对于禽类,常在翅内静脉采血,或在鸡冠部采血.当需要较多量血液样品时,应采取心脏穿刺采血法(主要是雏禽)方法是将鸡右侧卧保定,左胸部向上,取一个10毫升玻璃注射器,接上一个5厘米长的细针头(8-10号),从胸骨脊前端至背部下凹处连接线的中点,垂直或稍向前内方刺入约2-3厘米即可采得心血.成年鸡每周可采血10-20毫升.
3,马驴牛羊的颈静脉采血方法
⑴动物保定,使其头部稍向前伸并稍偏向对侧,局部进行剪毛,消毒.
⑵压迫充盈被采颈静脉血管,看准颈静脉沟,术者用左手拇指(或食指与中指)在颈部中下1/3近心端静脉沟处压迫静脉管,是回流的静脉血管充分充盈,怒张.
⑶右手持注射针头,沿颈静脉使与皮肤呈45度角,迅速刺入皮肤和血管内,待血液喷流出后即可用试管或小瓶盛装血液.
⑷采血完毕注意用5%的碘酊压迫局部并行消毒.
二,血清的分离
㈠自静脉或心脏采出的血样,一般可装在小试管中或带橡胶皮塞的抗菌素小瓶中.若分离血清,就不必加抗凝剂;若做血常规检验及全血分析,就应事先加入一定比例的抗凝剂,以防止血凝.(常用的抗凝剂有10%乙二胺四乙酸二钠即EDTA1:50;3.8%枸橼酸钠1:10等)
㈡血清的分离:就是采血后将装血试管或小瓶或一次性注射器斜置与水平面呈60度夹角,使其自然凝固或冬季放在25-37度的室温,水杯或水浴锅里静放2小时就可析出血清.牛羊和猪的血样,也可进行离心5-10分钟后再放入水杯,这样可以加快血清的析出时间.
㈢将析出的血清一一对应倒入洁净的试管和小瓶内加橡胶盖封装登记,编号,保存或送检.如保存时间超过7天可在每毫升血清中加入5%的石炭酸溶液1滴,以防止腐败变质.
分离好的血清一般保存在-5℃至-20℃。然而，若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
三，动物尸体剖检的意义和应注意的问题
㈠尸体剖检意义：尸体剖检就是对病死或其他原因致死的动物（家畜，家禽，实验动物，观赏动物，经济动物，野生动物等）尸体进行解剖检查。尸检的意义是多方面的。首先尸检是诊断疾病的重要方法之一。有些疾病生前没有作出诊断，必须在死后进行确诊。这在传染病和寄生虫的诊断方面尤为如此。有些，如中毒病，尽管死后以尸检的方法可能还不能确诊，但因每种疾病都有一定的病理变化，总可以提出怀疑疾病的方向。其次，尸检经常应用在兽医学和医学的多种研究工作中，因为通过尸检能发现某些疾病和病变的发生、发展和结局的规律性，为疾病的防制提出可靠的依据。在医学事业得到蓬勃发展的今天，医学科学工作者已经和兽医学工作者取得了更加密切的联系，在动物身上复制疾病并对其进行尸体剖检，已经成了他们共同的、必不可少的科研手段之一。再次，鉴于尸检能较正确地判断疾病的性质和死亡时间、原因等等尸检在法兽医方面无疑有十分重要的意义。由此而知，尸检对兽医工作者，兽医卫生检验工作者，医学工作者，以及法兽医都是重要的，它是改进和提高业务水平的一种极其有效的方法，也是对动物疾病的预防和治疗，以及保护人类健康，起着不可低估的作用。
㈡尸体剖检的时间、地点和器械
⑴时间 尸检应于动物死亡后尽快进行，因为尸体不断发生腐败分解，同时会出现其他一些死后变化，影响对病变的辨认。此外，尸检最好在白天自然光线下进行，因为有些病变（如黄疸，变性）的颜色很难在灯光下分辨清楚。
⑵地点 按要求，尸检应在特定的解剖室进行。在肉联厂或屠宰厂的急宰室进行尸检时，必须严格消毒，防止环境和器物污染。如无条件而急需剖检时，应选择地下水位低，比较干燥，远离水源、道路、住房、动物饲养场所而且环境比较避静的地方。严禁在市场或人员来往频繁的地方剖检。
⑶器械 剖检器械可根据动物种类和剖检目的而定，最常用的有：剥皮刀、外科刀、外科剪、肠剪、骨剪、骨锯、持针钳、斧头、骨凿、镊子磨刀石或磨刀棒。
㈢消毒和尸体处理
为了防止病原扩散，保障人和动物以及环境安全，必须在整个尸体剖检过程中保持清洁并注意严格消毒。剖检人员应穿工作服并戴手套和胶靴。注意在剖检前如遇动物尸体天然孔出血尸僵不全疑似炭疽等烈性传染病，应严禁剖检。可谨慎做血涂片作初步检验（如不是炭疽病感染的可以剖检）。剖检过程力求全面、客观、详尽检查。剖检后注意场地清扫消毒和监督处理尸体，防止疫病扩散。
四,猪、牛(羊)，鸡的尸检要领
㈠猪尸检注意要领:猪尸检采用背位, 一般不剥皮.体表检查尤为重要,常有特征性病变,如急性猪瘟皮肤有弥漫性出血点,亚急性猪丹毒背部皮肤有方棱型疹块.颌下淋巴结、扁桃体及附近组织检查不可忽视,猪炭疽病在这些组织中多半可发现较特征病变,如出血性坏死性淋巴结炎.脾脏检查也有重要意义,某些疾病脾有明显特征性变化,如败血性炭疽时,脾高度肿胀,紫黑色、柔软.急性猪丹毒脾肿,呈樱桃红色,急性猪瘟时脾发生出血性梗死.猪颅腔剖开时因猪脑位置深、额窦大,额骨横锯线可移至眼眶上突前1-2厘米处,为便于锯骨,最好预先挖除眼球.
㈡牛羊尸检要领:牛羊因前胃占据左侧腹腔,尸检取左侧卧位.同时要剥皮,充分利用皮张.
牛羊在剥皮之前,询问病史和体表检查极为重要,切记随便动刀剖尸,草率从事.如若怀疑炭疽或其他的人和动物的烈性传染病时,应先做血涂片检菌,确认阳性者停止尸检,按法规进行处理.所以说外部感官检查也特别重要.如尸僵眼结膜苍白,可怀疑贫血,内出血和造血系统的病.黄染,可怀疑肝胆疾病和血孢子虫病等.皮下脂肪检查除注意脂肪、血管、血液、水肿和体表淋巴结外,应注意牛皮蝇幼虫的寄生,外生殖器和乳房炎等病变检查.
为便于检查牛羊前胃创伤与横隔膜与心胆关系,可采取右侧胸腹腔同时暴露的剖检方法,沿腹中线和右胸肋关节切开,再锯断胸椎和肋骨连接即可.
羊的内脏小,可以一次摘除,牛胃肠大,应分段结扎后取出,结扎部位:第一是在距回盲口15厘米处,将回肠做双结扎后切断.第二是在十二指肠的空肠曲(左肾下,靠近结肠处)将肠管做双结扎后切断,再切断肠系膜便可取出小肠.第三是在骨盆腔内将直肠作单结扎后切断肠管和肠系膜,再割断前肠系膜根部,便取出大肠.第四在皱胃贲门前,结扎食管,以便摘取第四胃.
牛羊胃检查时注意内容物的性质、数量、质地、颜色、气味、成分和黏膜.特别注意皱胃黏膜的炎症和寄生虫.瓣胃阻塞干枯,网胃内异物(铁钉、缝针、玻璃等)刺伤,穿孔及瘤胃内容物情况.
牛羊泌尿生殖系统的检查比较重要,骨盆内的器官应和外部生殖器官得检查相结合.子宫内有胎儿时,子宫黏膜,胎膜,羊水,胎盘和胎儿的外部,内部器官等检查不容忽视.不孕症的牛死亡后,卵巢,子宫,输卵管及周围组织的检查更为重要.
牛胸腔检查中,应注意纵隔淋巴结,它是牛结核病检查首选部位.
养应注意鼻腔和副鼻窦剖检,特别是寄生虫的检查.
㈢鸡的剖检要领:鸡体表检查应注意羽毛状况,羽毛粗造或脱落,常为慢性病和寄生虫病的表现.雏鸡白痢及有腹泻症状疾病,在泻殖孔周围羽毛常被粪污粘.胸骨和龙骨嵴突出,软骨病时龙骨弯曲.皮肤检查应特别注意冠和肉髯的颜色,大小,同时观察头部,体部,颈部和腿部有无痘疹、出血和结节,以及有无骨关节肿大变形.由于鸡羽毛多,尸检时要事先用消毒药液浸渍消毒，以防尘土飞扬.
鸡胸腔剖开时,需用骨剪剪断鸟喙骨和锁骨.体腔视件检中注意气囊有无霉菌生长或其他病变,特别注意有无炎性渗出物,积血和卵黄性浆膜炎.
鸡各器官检查中,注意口腔,食道和嗦囊黏膜和内容物状况,如维生素A缺乏症时黏膜角质化.喉头和器官黏膜病变,如黏膜性鸡痘,出血性纤维素性支气管炎等,横剪鼻孔前的上颌,挤压鼻部检查分泌物的性状.肺的检查注意有无结节和肺炎灶,如霉菌性结节.肝检查意义重大,是鸡许多病症容易显现的器官.如马立克氏病和淋巴性白血病肿瘤结节,结核病结节,沙门氏菌病肉芽肿,巴氏杆菌病的小坏死点等.此外腺胃和肠黏膜是鸡新城疫典型病变的发生部位.腔上囊是鸡的重要免疫器官,鸡的腰荐神经丛和坐骨神经丛等是鸡马立克氏病的必检部位,常造成神经丛不对称肿胀和增生.
五,动物病理材料的采集和运送
病理材料采集正确与否直接影响病理组织诊断的准确性.所以要求做到以下几点:
⑴对病情不明的尸体采样时,尽量全面系统,分装固定,贴好标签.
⑵采样用刀,剪要锐利,切割要迅速准确,且忌拉锯式来回切割,并防止挤压病料,造成人为的变化.
⑶采集的每块组织标本应包含有病变和及其周围教正常组织,包含器官的重要结构组成部分,如肾应有皮质、髓质、肾盂等,肝、脾、肺应含有被膜.
⑷病料标本大小以2-3厘米厚,4×5厘米大小为宜,特殊的可5×8厘米大,以利于及时彻底固定.
⑸常用的固定液是10%的福尔马林(市售甲醛溶液10毫升加常用自来水90毫升),用量为标本体积的5-10倍,以防止挤压.
⑹胃肠胆囊等薄壁组织,为防止固定时卷缩,应将其浆膜面贴在厚纸张上后再放入固定液.
⑺每种组织应附以标签,用铅笔写好贴在瓶上或放在固定液中,同种组织可以用不同形状区分,并加记录说明,以防混淆.
⑻固定时间24-48小时,然后取出,用浸渍用同种固定液的脱脂棉包好,防在塑料袋中,放在木盒内邮寄.
⑼邮寄标本同时附上尸体剖检记录等有关资料1份,填写送检组织种类,数量,检验目的,病料所用的固定液类型,送检人及通讯地址.
六,动物微生物病料的采集
⑴细菌性病病料的采集,合理地采取含菌量最多的病料是做好细菌性疾病诊断的第一步.因此采集病料应了解各病菌在感染畜禽体内及其分泌物或排泄物中的分布情况.这是因为不同疾病的病原菌,在疾病的不同阶段和不同的病型中,其分布也不尽相同.为此应根据不同的病情,采取最适宜的病料,才能迅速准确地确定检验结果.①对活的病畜禽应采取其血液,口鼻分泌物,乳汁,浓汁或局部肿胀渗出液,体腔液,尿液,生殖道分泌物,粪便等.②死亡畜禽病料的采取:取材料时应剥去皮肤,打开胸腹腔,无菌采取病料.采取病料的种类应根据发病情况或对疾病的初步诊断印象,有选择性地采取相应含菌最多的脏器或分泌物.若分不清病的性质或种类时,可全面采集病料.
⑵病毒性疾病病料的采取:如从畜禽活体采取病料,必须在发病初期,急性期或发热期.否则,病毒可很快从血液中消失,组织内病毒的滴度也因抗体的产生而迅速下降.无论从活体还是尸体上采集病料,既要避免污染,又要防止病毒被灭活.其方法与细菌性疾病病料采集基本相同,采集的病料放入灭菌容器内密封送检.可以低温冻结保存,或置入装有保护剂的灭菌容器内.常用的保护剂有10%灭活兔血清,10%生理盐水,卵黄液,灭菌脱脂乳及50%的甘油生理盐水等.
⑶毒物送检样的采集:应根据毒物的性质,毒物进入机体的途径以及中毒的不同阶段,选择含量最高的部位采集.一般采集胃和肠的内容物、胃壁、肠段、肝、肾、血液、尿样、脑、骨、淋巴结以及引起中毒可疑的饲料等.急性中毒急宰或冷冻的肉尸.如缺少内脏时,还可以采集肌肉.实际工作中,由于进入集贸市场或超市的肉类多数不带相应的内脏,或仅携带部分脏器.因此,应尽量采取全肉尸和脏器上存留的可作检验的材料,以免造成贻误.
2007.5(王选 撰稿)
第二节 药敏试验的的作用、方法和结果判定
目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。因此，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。
一、什么是药敏试验
抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility test，AST），简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。
二、药敏试验的意义
1、可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。是一种既经济又有效的方法。
2、可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异。进行有效的药敏试验可以及时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。
3、为临床用药提供参考依据。因为一个正确的药敏试验结果，可作为临床兽医和畜禽养殖者选用有效抗菌药的参考。长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。近十几年，在肉鸡生产中，为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，一些抗菌药物的盲目使用，导致耐药菌株越来越多。根据已进行的大量药敏试验结果，大肠杆菌、沙门氏菌对曾经敏感的氨基糖苷类、氟喹诺酮类等，均产生了不同程度的耐药性，经常发现对十几种常用抗菌药都不敏感的菌株。这是一个非常危险的信号。所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。
三、常用的药敏试验方法
兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。
由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前牛津杯法和打孔法在兽医临床已较少应用。以下简单介绍纸片法。
1、药敏纸片的制作
纸片法中使用的药敏纸片目前市场上已有较多厂家的产品销售。但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：
取质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或小平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。按每张纸片饱和吸水量为0.01ml计，在上述含有50片纸片的小瓶内加入药液0.5ml，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30分钟即可。同时在记录药物名称，于37℃温箱过夜。在温箱或烘箱中的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。青霉素、金霉素宜在低温下真空干燥。干燥后即密封。切勿受潮，置阴暗干燥处或家用冰箱中保存，有效期4-6个月。(一般应在2月内用完).
2、药液的制备
自制药敏纸片时还需自行配制抗菌药液。抗菌药的稀释剂通常用蒸馏水。一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水浓度，按1g需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为：1g本品加5000ml蒸馏水。此溶液液即为用于做药敏试验的药液。(1毫克/每毫升浓度的溶液).
3、试验操作方法
在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。然后用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5－6片。记住每种药敏纸片的名称。贴完纸片的平皿15分钟后再置于37℃温箱中培养16－24小时，观察记录结果。以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。
药敏试验结果判定标准
抑菌圈直径（毫米）
| 敏感性
| ＞20
| 极敏感
| 15-20
| 高敏感
| 10-14
| 中敏感
| ＜10
| 低敏感
| 0
| 不敏感
|
实践证明，利用自制药敏纸片进行药敏试验，可以灵活选药，与某病菌相关的药物均可随时制作药敏纸片用于治疗。可在本场药品范围内或本地区容易买到的药品中选出最敏感的药物。还可在短时间内选择最佳药品和最佳剂量，既能缩短病程，又能避免盲目用药，减少浪费。
四、根据药敏试验选药原则
完成药敏试验后，应根据结果选择敏感性较高，同时价廉、易得、安全的药物进行治疗，以减少耐药菌株，同时还应注意以下原则：
1、在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。
2、药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70－80%，所以也不能过分地依赖药敏试验。如发现疗效不显著应及时换药。
3、药敏试验确定的首选药物不是一成不变。随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。
4、窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。
5、避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。
四、影响药敏试验结果的因素
在以纸片法进行药敏试验时，以下几方面因素可影响试验的结果：
1、培养基：首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。其次，倾注平板时，厚度应合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
2、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
3、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
4、培养时间：一般细菌培养温度和时间为37℃ 12-24小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。
五、药敏试验存在的问题
当前进行药敏试验仍然存在一些问题，主要包括以下几方面：
1、方法学不统一，没有标准化。
2、市场提供的药敏试验的培养基、药敏纸片等缺乏严格质控，质量难以保证。所以还是建议按要求自制药敏纸片。
3、因需要先进行细菌的分离培养，所以药敏试验报告出结果时间长，检验与临床缺乏沟通，对于基层兽医站或养殖场，药敏结果不能满足临床治疗要求，容易延误治疗时机。但根据有关报道，也可进行简易的药敏试验，方法如下：无菌取病死畜禽的部分肝、脾等组织，按1：5加生理盐水研磨制成悬液，静置5分钟，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5分钟后贴上药敏试纸，培养、观察抑菌圈大小。
4、对于部分营养需求较高的细菌或微生物，如链球菌和支原体，临床上较难培养，限制了药敏试验的应用。
5、部分养殖场或基层兽医站缺乏做细菌分离培养和药敏试验的意识。绝大多数养殖者或技术人员是在没有明确微生物学诊断的情况下使用抗菌药物，养殖场规模越小，细菌培养和药敏试验做的越少，有的养殖场轮翻使用多种抗菌药物而不做细菌培养和药敏试验，致使疗效不佳，治疗时机延误和药品的浪费。一些病例用药前不做药敏试验，而是在大量使用多种抗菌药物疗效不明显时才想起做细菌培养和药敏试验，而此时细菌已对多种抗菌药产生耐药性。
(2007.5王选 撰稿)
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发表于 2007-7-18 20:02:31
