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发表于 2009-11-12 16:38:55
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来自： 中国内蒙古乌兰察布
IgY的分离纯化一度成为难题，主要困难在于如何去除高浓度的脂类，提高IgY的纯度。IgY的广泛应用往往受到制于IgY的分离纯化，不分离纯化又降低了使用效果。
现在很多是用的水稀释法，即以9份水稀释1份卵黄，离心去除颗粒，再用硫酸盐沉淀法浓缩，并经超滤或乙醇沉淀或盐沉淀进一步纯化、浓缩，再经凝胶过滤提纯，产量达9.8mg igY/ml卵黄，纯度94%。此实验中以PEG代替硫酸盐沉淀，可进一步提高产量。Bade和Stegemann（1984）用预冷的丙烷和丙酮（－20℃）沉淀蛋白质并去除脂质，经DEAE柱层析进一步纯化，方法简便、省时。其IgY抗体活性与用Polson法提纯的IgY之间无明显差别。且稳定性好，经3次以上冻融，抗体活性未见改变。Hassl和Aspock用疏水交换层析和凝胶过滤二步法分离提纯IgY，虽然产量不及PEG或乙醇沉淀法，但活性相似，且纯度较高。
IgY的进一步提纯可用提纯其它蛋白质的方法。常见的有凝胶过滤、DEAE纤维素阴离子交换柱层析和亲和层析等方法。必须指出，许多动物IgG均可用蛋白A亲和分离。但IgY不能与蛋白A结合。McCannel和Nakai（1990）用DEAE离子交换层析分离IgY亚群。在提高磷酸盐离子浓度的同时，始终维持一定的pH值。固相金属离子亲和层析是一种蛋白质纯化技术。最常用的金属离子有Cu2+、Ni2+，Co2-、Zn2+。研究表明Fe3+离子与磷酸化氨基酸有很强的亲和力。结合于离子柱上的蛋白质常通过降低pH值或提高盐浓度或二者合并进行洗脱。Greene和Holt用固相金属离子（Fe3+）亲和层析，通过改变pH梯度，根据4个洗脱峰将IgY分为4个亚群。Marti等（1997）将重组蛋白抗原结合于Ni-NTA柱上，用免疫亲和层析纯化特异IgY，效果良好。Kim等用特异性IgY制成抗生物素蛋白质-酰化生物素系统的亲和层析柱，用于IgG的分离和提纯。用不同的提取方法所得的IgY分子量也各异。Bizhanov比较了氯仿、萄聚糖蓝(dextran blue,DB)和PEG三种提取IgY的方法，前者IgY产量比后二种方法高2～4倍；用SDS-PAGE分析其相应产物，发现DB法提纯获得三种主要的蛋白成份：34.7KDa、41KDa和66Kda，并含少量45Kda成份：氯仿法提取主要含两种蛋白成份：45.7KDa或75.2KDa；而用PEG提取获得以66KDa为主的蛋白成份，氯仿及PEG法提取的蛋白质中也包含少量41～80KDa的IgY。
脂类的去除
纯化IgY的过程中，如何有效的去除脂类对于IgY的使用和保存是至关重要的。目前采用的常用方法为有机溶剂抽提法、多用氯仿抽提法。有机溶剂抽提法制备过程耗时少，上清中脂类污染极微，同时，氯仿还可以使脂蛋白变性，通过离心除去。问题在于氯仿有残留、毒性。所以可结合其它方法应用于IgY的提纯。有机溶剂抽提法适用实验室少量制备，不适合工业化生产，原因是大量沉淀，不适合连续离心。在制备IgY时会发现用氯仿抽提得到的上清不适合用ELISA法检测，阴性值太高，其原因在于有氯仿残留影响了酶标板的吸附力，增加了非特异性吸附。
其它物理化学方法有反复冻融法(WD法)。通过反复冻融，蛋黄中的脂蛋白发生自凝聚，加速了抗体的溶解，经离心所获得的水相中脂类残留极少，日本的大量水稀薄法就是在此基础上发展的。
卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法
上海交通大学李荣秀发明的 一种卵黄免疫球蛋白的仿生亲和纯化方法，属于生物技术领域。本发明包括以下步骤：(1)基础层析介质与三氯三氮嗪反应活化后，分别与对氨基苯甲酸、以及酪 氨酸和精氨酸反应，合成仿生亲和分离材料；(2)用上述合成的亲和层析介质制备成亲和层析柱，将含卵黄免疫球蛋白的样品流过该亲和层析柱，卵黄免疫球蛋白 吸附在亲和层析柱上，冲洗亲和层析柱，不吸附在亲和层析柱上的杂蛋白被除去，然后变换缓冲液条件，再冲洗亲和层析柱，将结合的卵黄免疫球蛋白洗脱下来，得 到纯化的卵黄免疫球蛋白。本发明能够高效率、低成本的大规模生产高纯度的卵黄免疫球蛋白。鸡卵黄免疫IgY的一步纯化的回收率＞50％，纯度＞ 99.5％。鸭IgY和IgY(ΔFc)的一步纯化的回收率＞55％，纯度＞75％.
————摘自网络 |
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