【分享】MG的感染、传播、致病性和疫苗研发（精彩译文）

共享精神

MG的感染、传播

致病性和疫苗研发

摘要：支原体属于无细胞壁的细菌，基因组较小，可感染哺乳动物、爬行动物、鸟类和植物。鸟类支原体病，特别是在鸡群中，主要由鸡毒支原体（MG）和滑液囊支原体（MS）引起。它主要在呼吸系统、生殖系统和肌肉骨骼中引发感染和病变。

MG可通过水平和垂直途径传播。MG感染后诱发宿主的先天性免疫反应和适应性免疫反应。感染后，巨噬细胞会吞噬和清除MG，B细胞和T细胞在清除和预防MG方面发挥关键作用。MG的毒力因子包括粘附蛋白、脂蛋白、热休克蛋白和抗原变异蛋白，它们在侵入宿主细胞和致病过程中发挥关键作用。MG的防控依赖于生物安全措施、管理策略、早期诊断、抗生素的使用和疫苗接种。本综述总结了MG感染的致病机制和毒力因子，包括与粘附宿主细胞、抗原变异和免疫逃避相关的关键因素。综述还强调了当前疫苗的局限性以及未来疫苗研发的方向。

简介

支原体属是最简单的自我复制微生物之一，基因组大小在500到1500千碱基对（kbp）之间。支原体是家禽、山羊、牛、猪和鱼类等动物最重要的病原体之一。尽管支原体基因组较小，但它们采用复杂的分子机制与宿主细胞相互作用。支原体缺失细胞壁，系统发育上与低G+C含量的革兰氏阳性菌有关，其经历了退化性演化，属于软皮体纲。支原体细胞膜上含有脂蛋白。支原体缺乏生物合成途径，因此依赖宿主供应其营养。支原体脂蛋白在与宿主细胞相互作用和致病过程中发挥关键作用，因为它们通常与细胞外环境发生相互作用。

1898年，Nocard和Roux培养出一种能引发牛胸膜炎的生物，就此开启了一门新的科学领域——支原体学。直到20世纪初，关于支原体是细菌还是病毒仍存在争议。1935年，有科学家发现支原体与L型细菌具有相似的特性。支原体的另一个独特特征是使用UGA密码子编码色氨酸，这是由于存在可识别UGA的tRNA。

不同种类的非致病性和致病性支原体已在多种鸟类中有报道。大约有23种支原体被报道在鸟类中存在。其中，最重要和常见的支原体包括鸡支原体（M. gallisepticum）、滑膜炎支原体（M. synoviae）、爱荷华支原体（M. iowae）和美洲大鹅支原体（M. melegreditis）。在鸡和火鸡中，MS会引发感染性滑膜炎。在过去的十年里，据报道，MS能与IBV和/或NDV混合感染，引发呼吸道疾病。爱荷华支原体感染导致火鸡孵化率下降、胚胎死亡以及火鸡腿部问题。美洲大鹅支原体对火鸡具有宿主特异性，其感染与骨骼异常和气囊炎相关。

在这四种支原体中，鸡毒支原体（MG）是禽类和某些非禽类鸟类的主要病原体。这种高度传播性的微生物是鸡类和其他鸟类“慢性呼吸道疾病”的病因。MG感染的临床症状包括咳嗽、打喷嚏、流鼻涕和眶下窦肿胀。MG感染的后果包括死亡、胴体废弃增加、产蛋量降低、孵化率降低、饲料效率降低和体重增长减缓。由于MG对家禽产业造成的显著性能和生产损失，被认为是影响家禽的最具经济价值的致病性支原体。MG感染已在全球范围内有报道，并列入世界动物卫生组织（OIE）的关注列表。

MG可以导致多种鸟类患病，包括鸡。MG能引发火鸡感染性鼻窦炎，在北美导致了家燕结膜炎大流行。还有报道MG导致了一些鸟类的疾病，包括美洲金翅雀、紫雀和麻雀，以及一些观赏用鸟类，包括雉鸡、山鹑和沙鸡等。MG还能感染其他鸟类，包括孔雀、日本鹌鹑、鹧鸪鸟、鸽子、鸭子、鹅、黄颈亚马逊鹦鹉、大红鹳和游隼。对于鸡，MG不仅引发慢性呼吸道疾病，还容易与大肠杆菌和低致病性禽流感混合感染，导致严重经济损失。由于MG在鸟类中的高致病性和导致家禽产业巨大经济损失，本文对该物种的感染方式、致病机制和疫苗开发状况进行了全面综述。

传播方式

MG既可以水平传播，也可以垂直传播。

2.1 垂直传播

垂直传播可在卵泡内和孵化时的胚胎内发生。由于腹气囊与输卵管相邻，种鸡呼吸道感染MG后会形成经卵传播。传播率在不同条件下以及一次爆发中的不同阶段可能会有差异。在疾病急性阶段，当呼吸道中MG水平较高时，传播最为活跃。疫苗株ts-11也能够垂直传播。

2.2 水平传播

水平传播可通过气溶胶、孵化器内传播、与感染的鸡只直接接触或间接接触发生。环境因素和被污染的物品能够导致MG的间接传播。料槽中被污染的饲料是水平传播的主要原因。孵化器内蛋壳的残渣是造成孵化器内传播的主要传染源。研究表明，许多MG菌株会导致产蛋量降低，并且会由于胚胎死亡而导致孵化率降低，以及生殖性能降低。传播方式的示意图如图1所示。据报道，MG在生物体的多个部位可以存活很长时间，如羽毛、鸡蛋内容物、在人体皮肤存活一两天，以及在料槽中存活一天。定期清洁和消毒可以减少这种微生物的传播。



图1 MG的传播方式

致病性及宿主免疫反应

不同的支原体菌株具有宿主特异性，但一些菌株具备在多种物种中定殖的能力。支原体的烧瓶状结构具有末端突起，通常表现为滑动运动，末端突起结构有助于附着在宿主细胞上。胞外粘附分子GapA和CrmA会协助MG粘附于宿主细胞表面。在定殖于上呼吸道后，MG会扩散到下呼吸道，引发支气管炎、气囊炎和肺炎。附着后，MG通过引发炎症反应使气管内黏液增多。MG进入非吞噬细胞以逃避宿主免疫系统并在宿主体内不同脏器中继续传播。MG感染后宿主细胞释放的细胞因子能够激活白细胞，这在致病过程中具有关键作用。MG在附着于宿主细胞表面后，就会对气道和支气管上皮细胞造成侵袭。下一步涉及抑制宿主细胞内蛋白质和DNA合成以及减少黏液产生。MG对宿主细胞的侵袭会导致呼吸道病理学变化、免疫抑制和产蛋量下降。MG致病机制的简化版本如图2所示。


图2 MG的致病机制

当鸡通过直接接触或气溶胶感染时，体内MG的抗体滴度急剧增加，表明感染会引发强烈的体液免疫反应。在感染的第一周，IgM可以被检测到。在感染后2周，可以在气管中检测到IgA抗体滴度升高。大约在感染后3周，可以在气管中观察到B淋巴细胞的增殖。这些研究表明，鸡体液免疫反应对于对抗MG感染至关重要。

已经证明T细胞和B细胞对对抗MG感染具有重要作用。据报道，进行了胸腺摘除和法氏囊切除的鸡在MG感染后病症更为严重。在MG感染后，鸡气管中主要存在B细胞，反映了B细胞的关键作用。感染后的第4天，在气管的黏膜固有层中观察到CD4+T细胞和CD8+T细胞。在MG感染的某个阶段，细胞因子和趋化因子也发挥重要作用。炎症因子和趋化因子能够非特异性激活B细胞和T细胞。MG的脂蛋白能够激活toll样受体2（TLR2）并通过NF-κB通路引发细胞因子和趋化因子相关基因的高表达，如CCL-20、IL-8、IL-12、IFN-γ、IL-1b、MIP-1b、RANTES、CXCL-13和CXCL-14等。

上述研究表明，在MG初次感染后，在呼吸道中细胞因子和趋化因子介导了淋巴增殖性炎症反应。总的来说，MG能够诱导宿主先天性免疫和适应性免疫反应。巨噬细胞是吞噬和清除MG的重要组成部分。B细胞和T细胞在清除和控制MG体内感染方面发挥关键作用。因此，在疫苗接种后它们的反应非常重要。

实验室检测

确认MG感染通常采用两种方法：病原分离和核酸检测。诊断中也常常使用血凝抑制试验作为确认检测。血凝抑制试验只用作确认检测，因为会发生非特异性假凝集反应，特别是在注射灭活苗或感染MS后。传统培养方法需要专门的方法和昂贵的试剂，分子生物学的进展提供了快速和敏感的替代方法。聚合酶链反应、随机扩增多态性DNA、任意引物的聚合酶链反应和多重实时聚合酶链反应可用于鉴定支原体。在一些国家，ELISA是主要的确认检测方法。常用的血清学技术在诊断中的一个局限性是难以区分自发感染产生的抗体和疫苗接种引发的抗体。但MG的分离培养可能需要至少21天，甚至可能受到其他细菌快速生长的阻碍。分子遗传学检测，如多位点序列分型和测序，可以帮助区分疫苗株，但也需要时间。为了检测鸡支原体DNA，通常使用荧光定量PCR和常规PCR，而不是培养，但这两种PCR技术无法区分MS和MG。

毒力因子和免疫逃逸蛋白
MG编码了一系列毒性蛋白、粘附蛋白、脂蛋白、热休克蛋白和抗原变异蛋白。表1列出了与MG感染和致病性相关的关键毒力因子，每个毒力因子在MG的致病性和诱导免疫反应中都发挥了特定作用。


表1 MG感染过程中主要的毒力蛋白

5.1 粘附因子

MG对鸡呼吸道上皮细胞具有很高的亲和力，能够附着在它们的表面。支原体通过它们的端器（末端泡状结构）在呼吸道内定植。粘附宿主细胞是支原体感染的关键步骤，粘附蛋白在这一过程中发挥了至关重要的作用。GapA和CrmA是位于泡状结构内的不可或缺的粘附蛋白。MG表现出类似于人肺炎支原体的粘附机制。肺炎支原体中的粘附蛋白P1类似于GapA。除了主要的细胞粘附蛋白外，PlpA和Hlp3等纤维连接蛋白以及肝素结合蛋白OsmC样蛋白也有助于MG对宿主细胞的粘附和定植。

5.2免疫逃逸

MG的免疫逃逸受到vlhA基因家族的调控。该家族包括位于五个位点的43个vlhA基因。该基因家族的主要功能是产生抗原多样性，在感染期间协助MG免疫逃逸。VlhA基因家族在感染的急性阶段和慢性阶段期间存在抗原变异。抗原变异可能是由于生存压力或免疫压力而发生的，这对MG在宿主细胞中的生存至关重要。不同种类的支原体有不同的抗原变异机制，如基因转化、特异性位点重组和互惠重组等。VlhA基因的产物被认为参与了MG对宿主载脂蛋白A1和红细胞的粘附过程。在其他vlhA基因中，vlhA 3.03、2.02和4.07基因主要在感染的初始阶段表达，而vlhA 1.04在感染的后期表达。MG在感染的不同阶段表达哪种vlhA基因是随机的，其机制尚不清楚。

5.3 抗原变异

支原体的表型变异是其致病性和慢性感染的重要因素之一。宿主免疫细胞识别了一种被称为潜在细胞粘附相关蛋白（PvpA）的蛋白。PvpA是一种大小可变化的膜内蛋白，具有表面外露的C－末端。MG的PvpA与人支原体肺炎的变种，如M. pneumoniae和M. genetalium中的P30和P32蛋白，具有高相似性。

5.4 热休克蛋白

热休克蛋白具有高度保守性，可以保护细胞蛋白免受热休克、炎症和感染的损害。GroEl是热休克蛋白家族的一员，也被称为Hsp60或第1组分子伴侣蛋白。在MG中，GroEl被鉴定为一种毒性蛋白，具有粘附作用。

防控

在家禽产业中，最佳的预防方法是使用MG阴性的鸡只进行育种。维持阴性群，鸡只将不会感染、不会产生抗体转变，也不会患病。这将切断MG垂直传播或孵化场传播。如果由于任何原因无法实现这一目标，生产者需要学会与MG阳性群体共存，并采取各种预防策略，以最小化感染、传播、抗体转变、发病和生产损失。严格的生物安全措施和常规卫生措施对于避免MG感染和传播至关重要。在一个小地理区域内拥有大量家禽农场会增加暴露和疾病传播的可能性。需要建立有效的监测系统和早期诊断方法以预防或控制MG的暴发。

在人工授精时应注意卫生，以减少垂直传播的潜在风险。在一些国家，许多养殖场会使用抗生素来治疗和控制群体中的MG感染。家禽养殖场中最常用的抗生素包括截短侧耳耳素类、大环内酯类、氟喹诺酮和四环素类药物。广泛使用抗生素可能导致MG产生耐药性，使治疗无效。MG缺乏细胞壁，高度限制了可用抗生素的选择。使用抗生素的另一个问题是它们可能进入食物链，并可能对人类造成副作用。作为抗生素的替代方案，灭活苗和活疫苗使用了已有数十年时间。尽管在没有完全控制住MG的感染，但总体而言，MG疫苗可降低支原体载量、减轻病症，并减少生产损失。随着各国在努力减少畜牧业中使用抗生素，许多国家更青睐使用MG疫苗来控制MG感染。

疫苗

MG的疫苗首次由Adler及其团队提出，并自20世纪60年代以来一直作为家禽支原体病的控制措施使用。既有MG的灭活疫苗，也有活疫苗。常见商品化MG疫苗在表2中。由于耐药性的增加以及抗生素的减量使用，消除这种疾病通常需要新型有效的疫苗以及对现有疫苗进行改进。

在许多国家，已经使用了许多MG分离株来制备灭活疫苗。R株似乎已经供应了数十年，并且据报道免疫后能够减轻由于MG感染引起的呼吸道症状、呼吸道病变、经卵传播和生产损失。然而，其他人报道称，R株对控制MG感染和减轻呼吸道症状效果不佳。与活疫苗相比，油乳剂灭活疫苗的最大优势在于降低了毒力返强的风险，以及能够诱导产生高水平的抗体。


表2 常见商品化MG疫苗

7.1 灭活疫苗

在许多国家，已经使用了许多MG分离株来制备灭活疫苗。R株疫苗似乎已经供应了数十年，并且据报道能够减轻由MG感染引起的呼吸道症状、呼吸道病变、经卵传播和生产损失。然而，对R株疫苗保护效果的报道有所不一。与活疫苗相比，油乳剂灭活疫苗的最大优势在于降低了毒力返强的风险、能够诱导高水平的抗体以及对产蛋量下降的保护。

7.2 活疫苗

7.2.1 第一代（1975–2000）

首个活疫苗株是F株。许多实验研究已经证实了F株疫苗在预防气囊感染、呼吸道症状、产蛋量下降和经卵传播方面的有效性，并且对卵泡质量没有影响。在蛋鸡中，在开产前使用F株疫苗可以防止疫苗株进入卵泡中，尽管F株倾向于通过接触和排泄来传播。然而，F株疫苗可以引起肉鸡和火鸡的呼吸道症状，会造成火鸡发病。研究表明，F株可以在鸡的上呼吸道内一直存在。F株疫苗的免疫方式是滴眼、滴鼻或喷雾。

在20世纪90年代早期，美国开发了6/85疫苗株。这种疫苗株对鸡和火鸡不具有毒力，也不会在鸡群内传播。疫苗株会在接种后的4至8周内存在于上呼吸道，不会诱发强烈的免疫反应，这表明了6/85疫苗株在防御和诱发免疫反应方面欠佳。

ts-11疫苗株是通过对澳大利亚MG分离株进行化学诱导突变而开发的，其给药方式是滴眼。这种疫苗对火鸡和鸡的毒力较低或无毒力，不会在鸡群内传播。它可以提供对MG感染的保护，降低产蛋量的损失，并阻断MG的垂直传播。ts-11疫苗株接种后在鸡的上呼吸道中存在，并诱发长期免疫反应。ts-11疫苗的保护性具有剂量依赖性的，并在接种鸡中呈不稳定的免疫反应。一些研究显示，ts-11有毒力返强可能性，并且有垂直传播的风险。

7.2.2 第二代（2000年至今）

随着技术的进步，已经研究了许多MG疫苗候选株，如GT5、MG 7、K株和ts-304，以解决目前疫苗株存在的问题。GT5和MG 7疫苗株是从亲本株Rlow得到的。亲本株Rlow的连续传代导致了Rhigh株的产生，随后通过对Rhigh进行细胞粘附基因GapA的回补获得了GT5疫苗株。MG 7株是通过在毒力双硫缩酰胺脱氢酶（lpd）基因中插入转座子而开发的。使用GT5和MG 7株进行的实验性疫苗接种研究显示，这两株能够保护感染的鸡免受气管病变和降低MG在气管中的定植。K株能在上呼吸道内持续存在约5个月，并减轻MG引起的气管病变。K株的保护效果与F株和ts-11株的疫苗相当。ts-304是ts-11株的变种，具有GapA基因存在。能够在较低剂量下就对火鸡和鸡具有较强的保护作用。3周龄接种ts-304后诱发的保护性免疫反应至少持续57周。

7.3 基因工程疫苗

重组疫苗是目前的研究热点。这种疫苗是在合适的表达系统中克隆抗原表位。牛分枝杆菌中的功能性转座子，如Tn916和Tn4001，可以用于构建突变体、基因表达、细胞标记和蛋白质功能分析。迄今为止，已经开发了两种针对MG的重组疫苗候选株，即GT5和携带MG基因的鸡痘病毒。Zhang等人使用重组腺病毒在HEK293细胞中表达传染性支气管炎病毒（IBV）的S1蛋白和MG的TM-1蛋白。重组腺病毒成功表达了目标蛋白，产生了高水平的抗体，并显著减轻了IBV和MG感染后的临床症状。

未来疫苗研发的方向

MG高效疫苗的研发对未来至关重要。目前的大多数疫苗开发策略都基于单一抗原或不同抗原。因此，新的抗原表位疫苗是个大的方向。抗原表位是能够引发细胞或体液免疫应答的基本单位。多表位疫苗由一系列抗原表位的肽段组成，从而有助于预防感染或引发免疫应答。理想的多表位疫苗设计应该包括能够引发细胞毒性和辅助T淋巴细胞以及B细胞的免疫应答。与传统疫苗相比，多表位疫苗具有许多优势。它们生产更便宜，不涉及微生物培养，并且可以跳过多种实验程序，因此更节省时间。基于表位的疫苗还减少了毒力返强的风险。此外，抗原表位方便工程化和优化，以增强其诱发更强的免疫应答效果，并且由于它们的尺寸小而具有更高的化学稳定性。它们更加安全，因为不涉及整个病原体，而且非常稳定。由于存在多个表位，多抗原表位疫苗可以同时结合多个HLA等位基因，从而具有更好的免疫效果。已有以下家禽病原体开发了多表位疫苗：新城疫病毒、禽流感A（H7N9）病毒和艾美耳球虫。最近，提出了一种基于免疫信息学方法的多表位疫苗，用于对抗MG。使用重组疫苗技术可以使MG疫苗更安全和高效，尽管还需要进一步的探索和验证。

目前，大多数多表位疫苗的表达系统基于细菌、酵母和哺乳动物表达系统。这些传统的疫苗生产系统存在一些缺点。例如，在细菌表达系统中，存在的问题包括难以表达较高级别的真核蛋白质、内毒素积累以及表达细菌的蛋白酶污染。在酵母表达系统中，主要问题是高度糖基化，而在哺乳动物表达系统中，缺点包括高成本、细胞生长缓慢以及更高的污染风险。

在过去的二十年中，工厂和制药公司除了使用传统生产平台和技术来制造疫苗、药物和生物制品之外，以植物为反应器生产动物用疫苗的研究也引起了人们的关注。这是令人振奋的，例如以植物为反应器开发具有安全、有效、稳定且经济等特点的可食用疫苗，用此疫苗治疗包括传染性疾病在内的各种疾病。它还可以以低成本进行大规模生产，不受其他动物来源的交叉污染的影响，运输和存储过程中不需要冷链。此外，与其他表达系统相比，植物可以更好地产生和加工真核疫苗蛋白质。纯化的植物产生的疫苗可以通过肌肉、鼻内、眼内和口服途径进行接种。

制造植物源疫苗需要将目标基因转移到植物中以进行蛋白质表达。蛋白质表达可以通过稳定表达或瞬时表达来实现。当目标基因永久性整合入植物基因组中时，称为稳定表达，而在瞬时表达中，可以在不将目标基因整合到植物细胞基因组中的情况下实现所需蛋白质的生产。

理想的疫苗应该既有效又经济，易于大规模接种，能引发持久的细胞和体液免疫，非致病性，副作用较少，并且不污染环境。因此，在不久的将来，植物基础疫苗将因上述列出的优势以及它们的经济性而受到欢迎，因为它们不受其他动物来源的交叉污染的影响，可以轻松运输和存储，可以在短时间内大规模生产。

结论

健康养殖

鸡毒支原体（MG）是鸡和火鸡中最常见和重要的病原之一，感染这种病原体可能会导致全球鸡肉类或蛋类生产量降低。过去几十年来，包括活疫苗、灭活疫苗和重组疫苗在内的现有MG疫苗未能提供令人满意或一致的保护效果。随着MG耐药性的不断增长，寻找有效控制MG感染和损失的方法变得非常重要。基于MG的粘附和抗原变异蛋白的疫苗是预防和控制鸡毒支原体感染，维护家禽健康和生产性能的最合适选择。基于抗原表位的疫苗也是一个潜在的选择。尽管对这些潜在的疫苗进行了越来越多的研究，但最终疫苗的类型、安全性、有效性、功能机制和免疫原性都应通过体内研究进行验证。

来源：养殖宝，作者：Susithra Priyadarshni Mugunthan等，翻译：李培勇

了无痕

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