霉菌与霉菌毒素（三）

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霉菌毒素的检测

霉菌毒素检测过程包括样品的采集、样品的制备，最后是对样品进行分析。

1、霉菌毒素浓度的计量：ppb

1ppb=1?g/kg, 1mg /1000kg)；1ppm=1000ppb

·  相当于10亿分之1；

·  10的-9次方数量级,比较小的单位,类似的还有ppm,ppt等,分别是-6次和-12次。

·  相当于32年中的1秒

2、样品采集方法

在霉菌毒素检测的取样、制样和分析中都客观的存在一定误差。

由于真菌毒素的污染是极不均匀的，在农产品中的存在“10-9”水平，所以取样环节产生的误差最大，约占总误差的85％以上，而制样与分析两个环节共占总误差的15％以下。

霉菌毒素在饲料原料和饲料中分布不均匀：



均匀分布如蛋白质


不均匀分布如霉菌

（1）原料的采集：

散装原料：

可在卸货过程中，在车厢不同部位采集（8个点），总样本5公斤左右；

筒仓原料：

可在使用过程中，每隔1小时从传输带上采样（早班时采集，共8个样品），总样本5公斤左右。

袋装原料：用采样器不同包装袋中分别取样，8个点以上，总样本5公斤左右。



（2）成品的采集：

饲料厂：

包装前，每隔10分钟直接从出料口收集样本，8个点，总样本5公斤左右；

包装后，用采样器不同包装袋中分别取样，8个点以上，总样本5公斤左右。

养殖场：

应从多个料槽中采集样品，总样本5公斤左右。



3、样品处理方法

采样要注意代表性并防止污染，准备灭菌容器和工具，详细记录样品相关信息。低温干燥保存，及时检测。一旦采集好了检测样本，就应对其进行适当的处理以防止霉菌进一步生长。

潮湿样本在送检前应该进行冷冻或干燥处理，同时样本的运输时间尽可能地短。

然后，必须对样本进行细磨，将其制备为子样本以供分析；这一步骤是样本分析过程中第二大误差的来源。粉碎粒度越小，样品均匀度越好。如果样品粉碎粒度不佳，可以将粉碎样品放入搅拌机中加入适量溶剂（水或庚烷）搅拌成泥浆状。



4、样品中霉菌毒素的分析

（1）目前霉菌毒素的检测方法主要包括高效液相色谱质谱联用法、高效液相色谱法、酶联免疫法、气相色谱法、胶体金免疫层析法和上转发光免疫分析法等。

2021年农业行业标准《饲料中37种霉菌毒素的测定液相色谱串联质谱法》发布，并于4月1日起实施。由该院农业质量标准与检测技术研究所饲料质量安全检测与评价创新团队制定的该项标准，是全球首个饲料中霉菌毒素高通量检测标准；其成功研发并发布，扩大了我国饲料及畜产品中霉菌毒素监测范围，提升了风险发现能力。

（2）饲料生产企业多采用成本较低、检测快速、操作简便的胶体金免疫层析法和上转发光免疫分析法来评判饲用原料及饲料成品的毒素污染程度。

（3）农场养殖者可以通过简单的方法来评估玉米中的毒素水平：

·  如果发霉、生虫、干瘪、破碎综合比例达1%，对应黄曲霉毒素B1水平约为3.5ppb；

·  达到5%时，对应黄曲霉毒素B1水平约为20ppb。

（4）饲料中霉菌的污染除了专业仪器的分析以外我们可简易的由以下的变化得知：包含有饲料谷物粉化及结块、饲料有轻度异味发热、色泽变暗及偶尔畜禽拒食。

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霉菌毒素的控制

动物饲料中的霉菌毒素是世界各地畜牧业产量损失和管理费用增加的主要原因之一。

因此，“防病必先防霉”的口号是很有科学根据的。防霉的主要措施有：

1、预防霉菌毒素污染。

2、饲料中的霉菌毒素解毒。

3、霉菌毒素在胃肠道的吸收抑制。



一、霉菌与霉菌毒素的控制

（一）预防霉菌毒素污染

1、收获前预防措施：减小田间作物的应激与霉菌毒素的积聚

·  包括培育抗性作物

·  良好的农艺实践（如灌溉以防止植物应激）

·  轮作：减少产生霉菌毒素的霉菌的土壤种群

·  最佳成熟阶段收获。

2、选用优质饲料原料：

避免饲喂明显发霉的谷物饲料和饲草



3、减少饲料生产、贮存、运输中霉菌毒素的累积：

· 贮存条件对温度、湿度、通风控制：水分控制在12%以下；相对湿度不超过70％；包装袋密闭性

·  饲料生产：严格定期的卫生检查方案；储罐、搅龙的卫生；制粒后水分的祛除；

·  饲料中添加防霉剂

· 农场的输送系统与频率减少饲料在农场的存放时间：在10天内将运来的饲料用完

·  运输饲料产品应防止途中受到雨淋和日晒。

4、青贮料：

·  制作青贮时要注意水分含量或成熟度；

·  青贮玉米要现喂现采，注意压好保护，避免二次发酵发霉。



（二）饲料中的霉菌毒素解毒办法

虽然在饲料储存环境中，严格控制温度和湿度可减少霉菌的生长。但通常情况下，90%以上的霉菌毒素已经在饲料和草料收获前已经存在。因此，人们通过包括生物、化学和物理方法在内的解毒过程来消除、破坏或减少毒性作用。

（1）烘烤法

这是较原始的一种脱毒方法，它通过将受污染的饲料在110--160℃的高温下烘烤20-30min。虽然热处理可降解饲料中的部分霉菌毒素。但70%以上霉菌毒素的熔点在 150°C 和250°C 以上。这样的温度条件会破坏维生素并使蛋白质变性，从而降低营养价值，通常已不再采用。

（2）辐射法

紫外线照射不但可以杀死霉菌的菌体，还可以破坏霉菌所产生的毒素。将污染上黄曲霉的饲料铺成薄层，用高压汞灯紫外线大剂量照射，去毒素率可达97%--99%(王建华，1995)。但这种方法常占用较大的面积，难于大批量实行，同时也会对营养成分有部分破坏。



（3）其他方法：

挑除法、暴晒法水洗法、液体抽提法等，往往机械化程度不高，劳动量太大，难以规模化进行，而且准确度得不到保障。

2、化学脱毒法

（1）碱处理

实际生产中常用石灰水和氨处理污染的饲料，黄曲霉素结构中的内酯环在碱性条件下被打破而形成香豆素钠盐，从而破坏毒素，达到去除目的。氨处理对黄曲霉素是实践中最常用、较有效的办法。通常将污染玉米的含水量升至超过18%超过25℃时用氨蒸气处理14d后，再将玉米干燥使其水分降至10%以下，除去玉米表皮中的氨。通常氨浓度达2%就有效，但对玉米赤霉烯酮效果不理想，可能是由两者结构上的差异造成的。

（2）氧化剂处理

用氧化剂(攻击分子的不同部位)重亚硫酸盐过氧化氢漂白粉和氯气试图通过改变毒素结构，但结果不一致。

值得注意的是：

尽管这些化学处理中的大多数可以去除饲料中的霉菌毒素，但化学解毒不符合粮农组织的要求，因为它们通常会降低处理过的饲料的营养质量，并且一些化合物会留下具有不利副作用的有毒代谢物。这是它们在动物饲料领域的广泛使用受到严重限制的根本原因。

3、生物技术解毒

生物解毒是指通过生物转化剂（例如内源性酶）将毒素生物转化或降解为代谢物，该代谢物在动物摄入时无毒或毒性低于原始毒素并易于从体内排出。如内脂酶可断裂玉米赤霉烯酮的内脂环，环氧化酶降解单端孢霉烯毒素。

但实际应用中，一是酶不耐热，在饲料的制作过程，尤其在颗粒饲料压制的高温过程中易于失活；二是酶脱毒法成本较高，难以接受。

微生物还有通过微生物的发酵来去除霉菌毒素，但这种生物转化过程往往存在缓慢及不完全的缺点，所以到现在为止还不能用于饲料脱毒的实践中。

随着分子生物学、基因工程和微生物基因组学的最新发展，以及微生物种群分解代谢能力的发现，该领域的研究已经扩大。



4、营养解毒法

添加一些抗氧化剂，如维生素A、维生素C、维生素E和硒、色素等会缓解霉菌毒素对细胞的作用。营养解毒法虽可起到一定的解毒效果，但也有可能造成营养物质的浪费。

5、吸附剂脱毒法

这是目前应用较广，最为成熟且经济可行的一种毒素脱毒方法。通过在配合饲料中加入各种霉菌毒素吸附剂来降低其生物利用度，从而减少霉菌毒素的吸收和转运到血液和靶器官。

吸附剂是高分子量物质，在到达胃肠系统（水介质）后，可以结合霉菌毒素，阻止其吸收，并允许粪便排泄这种吸附剂-毒素复合物。它们不会在动物的胃肠道中解离，从而防止或最大限度地减少动物与霉菌毒素的接触。



5.1无机吸附剂

无机吸附剂对霉菌毒素的吸附效果受吸附剂的物理结构和霉菌毒素的理化性质影响， 具体包括比表面积、溶解性、电荷分布和极性等(Avant ag gia to etal.，2005) 。一般来说， 吸附能力随着比表面积和化学亲和力的增加而增加(Natalee tal.，2009)。

使用的一些无机吸附剂包括天然粘土产品以及合成聚合物。活性炭、水合铝硅酸钙钠 (HSCAS)、沸石、膨润土和某些粘土是研究最多的吸附剂，它们对霉菌毒素具有很高的亲和力，并且在动物饲料中显示出巨大的潜力来克服黄曲霉毒素中毒。

吸附剂在预防黄曲霉毒素中毒方面非常成功，尽管它们对其他霉菌毒素的效果不那么有效。主要霉菌毒素可被至少一种吸附剂充分吸附，但少数吸附剂可用于各种霉菌毒素，但没有一种吸附剂对所有毒素均有效。（表 3）



5.2 有机吸附剂

寡糖又称低聚糖(包括果寡糖、乳寡糖、木寡糖甘露寡糖等)，研究发现此类聚糖能通过物理吸附方式吸附毒素。对玉米赤霉烯酮、呕吐毒素等效果较显著，且安全、无毒，还可促进肠道中的双歧杆菌和乳酸菌等有益菌增殖，降低肠道中pH，抑制病原菌的滋生，提高动物机体的免疫力。

酵母细胞壁上的多糖、蛋白质和脂类产生的特殊结构，通过氢键、离子键和疏水作用力对霉菌毒素产生吸附力。Gardner(2004) 发现， 从澳洲白蚁小肠后部，分离出来的酵母菌株，能有效的降解赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮。酵母细胞壁可以吸附2.7mg/g玉米赤霉烯酮， 并且可以在10min内达到平衡。

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霉菌毒素吸附剂

正确认识霉菌毒素的危害是控制霉菌毒素的前提条件，选择正确的霉菌毒素吸附剂是控制霉菌毒素的根本保证。

物理吸附法目前被公认为最经济有效的方法：通过在含毒素的饲料中加入不同的吸附剂来去除霉菌毒素，即在饲料中添加可以吸附霉菌毒素的物质，使毒素在经过动物肠道时不被动物所吸收，直接排出动物体外。

一、理想的霉菌毒素吸附剂应该具备的条件：

二十世纪八、九十年代，人们尝试用辐射、日晒、氨化、热处理、稀释等的一些方式对付霉菌毒素，但结果都不能让人满意。之后，人们开始把研究的重点放在霉菌毒素吸附剂，各种霉菌毒素吸附剂产品应运而生，但产品的优劣真伪差异很大，难以判断。选择霉菌毒素吸附剂应将实用与科学放在首位。



1、 必须具备高吸附能力：

高吸附能力来源于巨大的吸附表面积。沸石粉平均比表面积为 18平方米/克，高岭土平均比表面积是23平方米/克，脱霉素（前一代）比表面积为 848平方米/克。如果一产品缺乏此数据，有可能是此产品缺乏基础研究。原则上选择产品第一关是看比表面积大小。比表面积在 600 以下，通常有较大的层间通道，为吸附营养物提供较大的机会。

吸附与黏附有本质的区别，吸附一般解释为“高强度的结合”， 而黏附为靠巨大的表面积粘着部分毒素，而不是结合。这些毒素在肠道蠕动过程中会游离出来，被吸收进入血液，从而产生毒害作用。活性炭虽然有巨大表面积，但在动物体内并不能用来预防黄曲霉毒素中毒，原因是它不能将黄曲霉毒素真正地结合掉。



2、 选择性吸附：

理想的毒素吸附剂应具备只吸附毒素，不吸附营养物的特点。

至今在国际权威学术刊物上发表的有关选择性吸附的文献非常有限。

美国霉菌毒素委员会为此特别强调, 只有通过实验证明只吸毒素，不吸收营养物，才可称作具备选择性吸附的特点，否则不能自称具备选择性吸附特点。

3、广谱吸附：

要求在较高毒素浓度的前提下对多种毒素能够很好地吸附。能同时特异性地吸收黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素等六种毒素。

4、无副作用：

意为此类产品不能有明显的对动物或人类食物链不利的作用或污染。



①不能吸收大量的营养物。动物在毒素高浓度存在时，对微营养物的需求较平时高。此条决定沸石粉及膨润土不能作为毒素吸附剂使用；

②吸附剂不能含有对人类食物链有污染的物质如二恶因。二恶因在人体内致癌潜伏期可达20年以上。在西方国家，二恶因被列为第一号污染物。中国饲料行业至今尚没有对饲料中二恶因污染进行系统检测，美国的膨润土已被多次报道含有超标的二恶因，因此每一家公司在进口时应提供二恶因合标的证明。

5、必须具备实验室及动物实验双重资料方能证明有效：

许多公司只提供实验室具备吸附能力的资料，活性炭在实验室内证明能吸附一定量的黄曲霉毒素，但在动物实验中却不能预防动物中毒，说明仅靠实验室实验结果不足以证明产品的功效。



二、现在市场主要的毒素吸附剂有哪些种类？

目前，霉菌毒素吸附剂类型包括：

①天然铝硅酸盐：如沸石、蒙脱石、硅藻土、高岭土等，具有较大的比表面积和离子吸附能力；

②有机吸附剂：

·  酵母细胞壁：10分钟内吸附。

·  酶分解毒素

③复合吸附剂：目前最理想的毒素吸附剂。

来源：谭谈球虫，作者：谭校长

王日田

好文章，拜读了

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