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发表于 2006-9-26 19:55:12
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[center]腺胃病变型鸡传染性支气管炎的诊断研究
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[center][center]朱国强王永坤严维巍周继宏庄国宏?
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[center]田慧芳孙龙生王碧林朱坤熹?
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?摘要：1995年以来在江苏一些市县养鸡场和养鸡专业户蛋鸡群流行以生长阻滞，剖检表现为腺胃显著肿大为特征的一种原因不明的“鸡传染性腺胃病”。通过病原分离、鉴定，血清学检测，病原免疫原基因分离、鉴定，病料组织核酸点杂交等方面诊断研究，证明本病是一种新近报道的腺胃病变型为特征的禽传染性支气管炎。
?关键词：禽传染性支气管炎 腺胃型 诊断
?自1995年3月以来，在江苏省7个市、县的部分养鸡场和养鸡专业户的蛋鸡群暴发了一种原因不明的传染性疾病，病鸡的临诊表现为生长停滞、消瘦，精神萎缩，剖检的主要特征为腺胃显著肿大，粘膜水肿、充血、出血和坏死形成溃疡，当时将该病暂称为“鸡传染性腺胃病”。本病主要发生在20～80日龄的蛋鸡，肉鸡也有发生。疫区鸡群的发病率为30%～50%，致死率在30%左右。山东、浙江、山西、辽宁等地相继发生，河北、辽宁、北京、天津、福建、广东、四川、云南也有发生(范根成等(1998)，私人通信。近来，法国也有类似疫病发生(Laurent1998，私人通信)。至今，该病在临床中尚未明确重视，许多基层兽医站和养殖户将它与马立克氏病，慢性新城疫或维生素E和亚硒酸盐缺乏症等病相混淆，给养禽业造成很大的危害。根据流行病学调查和细菌学检验，排除了细菌性传染病的可能性。通过病原分离鉴定，病原免疫原基因分离、鉴定，血清学以及病料组织核酸点杂交等方面系统比较研究，证明本病是一种新近报道的腺胃病变型鸡传染性支气管炎。
1 材料与方法
1.1 被检材料 来自江苏、辽宁、山西、浙江四省地不同疫区的自然发病和死亡鸡(20～100日龄)，无菌采取肿大的腺胃病科。
1.2 病理学观察 对自然发病及死亡鸡进行系统的病理剖检，病鸡腺胃组织用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜观察。
1.3 病原分离鉴定 取腺胃混合病料经无菌检验后，尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚，弃去24h内死亡胚，收集胚尿囊液，盲传2～3代SPF鸡胚，观察胚体变化及死亡情况。收集SPF胚尿囊，差速离心及密度梯度离心纯化病毒粒子，经醋酸铀负染，电镜观察病毒粒子大小和形态。
1.4 单抗介导的间接ELISA 抗原为提纯的病毒液，每孔包被1μg，一抗为抗IBVM41标准株或分离株H95单抗，二抗为工作浓度1：10000稀释的羊抗鼠酶标抗体(Sigma)，采用常规ELISA程序进行。
1.5 血凝和血凝抑制试验 将上述SPF鸡胚传代尿囊毒分离株H95、S96分别经胰蛋白酶和卵磷脂酶C处理后，进行血凝试验和血凝抑制试验。
1.6 S1基因的分离鉴定
1.6.1S1基因的分离 SDS-蛋白酶K法抽提病毒基因组RNA，参照IBVBeaudette标准株的发表序列，设计并合成一对可扩增IBVS1全序列的寡核苷酸引物。以病毒基因组RNA为模板，在上游引物的引导下，反转录合成第一链CDNA。以此cDNA为模板，PCR扩增分离株的S1基因，琼脂糖电泳分析PCR产物，同时设标准株T和新城疫E48F8株分别为阳性和阴性对照。
1.6.2S1基因的鉴定 以IBVBeaudette株S1基因片段(江国托博士赠)随机引物法制备的地高辛标记的核酸探针与RT-PCR产物分别采用BstYI、HaeⅢ、XcmⅠ三种限制性内切酶消化，鉴定分离株S1基因。
1.7 组织核酸点杂交 将疫区疑似本病的病鸡腺胃组织制备组织悬液，采用Promega公司的RNAgentsTotalRNAIsoationSystemKit说明进行组织核酸的提取，以S1探针进行斑点杂交。以正常腺胃组织抽提核酸和尿囊液病毒作为阴性和阳性对照。
2 结果
2.1 肉眼病理变化 病鸡尸体极度消瘦，个体比同龄健康群明显为小。剖检见腺胃明显肿大，剖开可见其粘膜乳头水肿突起，有的粘膜发生充血和出血，有的因粘膜组织坏死而形成凹陷的溃疡，周边出血，肌胃瘪缩，肌肉驰软。
2.2 病理组织学变化 腺胃粘膜表面上皮完全破坏脱落，固有层水肿，有多量炎性细胞浸润，腺管大部分结构破坏，有的结构完全消失。粘膜浅层发生凝固性坏死，粘膜下浅层和深层腺体层均可见明显炎症变化。
2.3 病原分离及形态学 自SPF鸡胚传至第2代时出现死胎，随着传代数递增，死亡率逐步增高，死亡时间多集中于72～96hr，胚体充、出血明显，肝脏有土黄色坏死灶，肾脏有尿酸盐沉积，活胚体卷缩，呈典型侏儒胚。电镜下完整的病毒粒子略呈球形，有囊膜，大小在80～160um之间，囊膜表面有稀疏的纤突，顶部膨大，长约20nm左右，呈冠状排列，大多数病毒粒子纤突已丢失。
2.4 单抗介导的间接ELISA检测 病变腺胃或分离株提纯抗原都能被抗M41株或分离株H95单抗所识别。
2.5 血凝和血凝抑制试验 SPF鸡胚传代绒尿液无直接血凝活性，经胰蛋白质酶和卵磷脂酶C处理后出现血凝活性，其血凝价可达4～5log2以上，且卵磷脂酶C处理的浓缩胚尿囊液的血凝活性能被相应的特异性抗体所抑制。
2.6 S1基因的分离鉴定 经RT-PCR反应，扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳，出现一条特征性条带，约1.7kb，经Southernblot，S?1探针检测呈阳性，而与此平行对照试验的T株与NDVF48E8株分别为阳性和阴性。PCR纯化产物进一步采用BstYI、HaeⅢ和XcmⅠ三种限制性内切酶消化，BstYI酶切出现600bp、550bp和300bp左右三条可见条带，HaeⅢ酶切出现400bp、350bp两条条带，XcmⅠ酶切出现1500bp左右一条可见条带。
2.7 斑点杂交 病变腺胃组织核酸经S1探针点杂交呈阳性，而平行对照的尿囊液病毒和正常腺胃组织抽提核酸则分别为阳性和阴性。
3 小结与讨论
?本病最早于1995年3～4月江苏流行，当时暂定名为“鸡传染性腺胃病”，现在全国不同省地流行。从不同疫区流行的以鸡腺胃肿大为特征传染病病例中，通过病原分离、电镜形态观察，血凝和血凝抑制试验及间接ELISA检测，病毒免疫原基因分离鉴定及三种特定的限制性内切酶谱分析，病料组织核酸点杂交等几方面诊断研究均证明，目前流行的以鸡腺胃肿大为特征的传染病为禽传染性支气管炎，并进一步通过流行病学调查、病原理化特性、动物回归试验得到验证。
? 临床上依据发病症状，主要病变部位和病毒组织嗜性及损害主要器官等特征，一般将鸡传染性支气管病毒分为呼吸型、肾型和肠型。目前在全国各地流行的以鸡腺胃肿大为特征的传染病，应用常规呼吸型和肾型传支疫苗均不能有效的预防。从病鸡肿大的腺胃病料中很容易分离到病毒株，用相应毒株制备的灭活疫苗能较有效地控制该病在疫区的流行。根据IBV多变异、多病变型特点，结合我们以前的研究，我们暂命名该病为一种新型的腺胃病变型鸡传染性支气管炎[7]，有关病原及相关分子遗传背景有待进一步深入研究。
?摘要：从屏障系统的建立和维持两方面阐述了应该怎样饲养SPF鸡，提出了建立洁净的生物环境是前提，维持洁净的生物环境是关键，只有切实做好卫生消毒工作，保障鸡场的生物安全，才是SPF鸡场饲养成败的关键。
?关键词：屏障系统生物安全卫生防疫
?为了提高生物制品的质量，近期在山东召开的全国生物制品理事会传出的消息，《规程》(2000年版本)将规定禽类疫苗的制备和鉴定所用实验动物(鸡，鸡胚)应符合三级(SPF级)标准。SPF鸡的饲养在我国起步较迟，规模较小，98年底我国SPF鸡的存栏量只有3万多只。95年12月至96年6月，作者到美国SPAFAS公司进行为期6个月的鸡场实地培训SPF鸡的饲养管理技术，回国后结合实际，学以致用，创建了南京药械厂SPF鸡场。目前南京药械厂SPF鸡场共有3个鸡舍，每个鸡舍饲养2700只SPF鸡。现将我们的具体做法介绍如下，以期对同行有所帮助。
1屏障系统的建立
1.1鸡舍设有熏蒸间，门前设有浸泡缸，任何进入鸡舍的物品都应在此2次消毒，以确保进入鸡舍的物品不携带病原微生物。
1.2鸡舍设有淋浴间，任何进入鸡舍的人员都应在此淋浴。
1.3空气经三级过滤进人鸡舍，初效滤器是EU-4级，过滤效率是30%；中效滤器是EU-5级，过滤效率是65%；高效滤器是HEPA型，过滤效率是99.97%。必须100%保证鸡舍没有漏隙，否则造成污染。滤器阻力显示器提醒工作人员及时更换滤器。滤器可以从烟台净化设备厂购买。饲养区的环境指标见表一。
?表一 屏障系统的环境指标
项目 单位 标准数值 南京药械厂SPF鸡场
温度 ℃ 15～28 18～35
相对次数 % 40～70 45～65
换气次数 次/小时 8～15 15或更高
气流速度系统 米/秒 0.13～0.18 0.13～0.18
空气过滤系统 / 初,中,高 初,中,高
空气清洁度 / 1000级 10000级
压力差 Pa 20 50
氨浓度 ppm <20 <20
噪音 dB <60 <60
工作照度 Lux 150～300 /
动物照度 Lux 20～100 20～100
菌落数 / 3个/皿 0.5～5.0微米的尘埃<350个/升空间
1.4 不清来自深井的地下水，经静置沉淀，大孔过滤(5微米)，树脂软化，紫外线消毒(型号是MP-2-SL，紫外线额定波长是254毫微米，平均处理能力是l.65立方米/小时)，小孔过滤(0.2微米)，次氯酸钠消毒后，才输入鸡舍供鸡饮用。
1.5 彻底地清洗鸡舍?鸡群淘汰后，粪便一次性清除。对于鸡舍内所有的设备及饲养工具，能拆除的一定要拆除，以确保能够清洗干净。将设备和饲养工具移到鸡舍外面，以便空出鸡舍，便于打扫。对于鸡舍的天花板，墙壁，地面(天花板和墙壁由库板拼成，水磨石地面，都易冲洗)，先用洗涤液刷(选择去污能力强的白猫或加佳洗涤液)，再用高压水枪彻底冲洗干净。由于金属物品不易刷干净，所以先用钢丝刷，再用高压水枪彻底冲洗干净。对于饲养工具先用洗涤液(选择白猫或加佳)和消毒液(君乐)的混合溶液浸泡，再用高压水枪彻底清洗。地面消毒(新洁尔灭)后，浸泡消毒(君乐)物品，再将物品移人鸡舍内。鸡舍内部彻底喷雾消毒(敌菌杀)后，重新安装设备。试运行一周，封闭鸡舍，多聚甲醛熏蒸2次，每次至少熏蒸6小时，至少24小时后启动风机。间隔一段时间，方可投入使用。多聚甲醛的使用方法见表二。
?表二 多聚甲醛的使用方法
厂家 鞍山市消毒剂厂
性状 白色粉末,HCHO>90.0%
原理 和菌体蛋白的氨基发生烷化反应,蛋白变性
方法 直接放入锅内加热至150,加热40分钟,维持20分钟
用量 鸡蛋为7.0克/立方米空间,其它物品加倍
范围 细菌,芽胞,病毒,霉菌,甚至昆虫和虫卵
2 屏障系统的维持
2.1 人流
2.1.1 由于鸡场工作人员居住在南京药械厂(生产多种禽类疫苗)，所以进出鸡场都应淋浴更衣。
2.1.2 经允许的参观人员只能站在鸡场门口，严禁人内。
2.1.3 饲养员食住鸡场，每天进出鸡舍都应分别在控制中心淋浴间和鸡舍入口处的淋浴间洗澡更衣。因为3个鸡舍的饲养员在一起吃饭，住的房间靠得很近，相互接触较多，所以在控制中心也一定要洗澡。
2.1.4 原则上工艺员一天不允许进多个鸡舍，否则每次都应分别在控制中心淋浴间和鸡舍淋浴间洗澡更衣。
2.1.5 鸡场外，生活区，饲养区，鸡舍内部的衣服不允许相互串穿。每个鸡舍都有各自专用的洗衣机，洗前先用消毒液浸泡。
2.1.6 为了确保淋浴的效果，鸡场提供杀菌力强的舒肤佳香皂和潘婷洗发液。
2.2 物流
2.2.1 饲料多层袋装，经CO-60产生的射线辐射，灭菌处理消毒后，进入鸡场。在饲料库用多聚甲醛(HCHO)熏蒸消毒后，送到鸡舍熏蒸间外，除去饲料袋外包装，先用烧碱溶液浸泡消毒，再用多聚甲醛蒸蒸消毒后，才可送人鸡舍，供鸡食用。为了弥补辐射消毒对维生素的影响，我们在饮水中添加多维。
2.2.2 经常检查水质，确保水中的有效氯含量达5ppm。
2.2.3 每天打扫出风口3次，确保鸡舍内维持60帕斯卡(Pa)左右的正压。
2.2.4 鸡舍所需任何物品都应在确保洁净(能拆洗的要拆洗)的前提下，分别在饲料库熏蒸间多聚甲醛薰蒸，鸡舍门前浸泡缸烧碱溶液浸泡，鸡舍熏蒸间多聚甲醛熏蒸消毒后，才可进入鸡舍。
2.2.5 将鸡舍专用的塑料蛋盘用于鸡舍和蛋库之间的周转。从外商购买的纸质蛋盘只用于从蛋库向外发货，而不进入鸡舍。
2.3 环境的消毒
2.3.1 鸡场入口处的消毒池及隔开生活区和饲养区的消毒池，每周更换1次，特殊情况，随脏随换。鸡舍入口处的消毒盆，2～3天更换1次。所有的淋浴间每周都应冲洗消毒1次。鸡场主干道每周冲洗消毒2次。
2.3.2 外界车辆不能进入鸡场，内部车辆不能外出，饲养区车辆和生活区车辆严格分开，按区使用，每次使用前后，都应确保洁净并消毒车辆。
2.3.3 每天完成鸡舍内的工作，准备离开鸡舍时，都应清扫并喷雾消毒鸡舍工作间。
2.3.4 死鸡袋装熏蒸送出鸡舍后，应及时焚烧，不能乱扔。
2.3.5 淘汰鸡时，应由鸡场专用的鸡笼运送鸡只，鸡笼在使用前后都应冲洗消毒，沿专门的道路运送鸡只和粪便，每天下班前都应消毒路面。
2.3.6 搞好鸡场环境卫生，确保排水畅通，定期除草，杀虫，灭鼠，灭蝇，消除传染源隐患。
3 屏障系统的检测
3.1 SPF鸡舍在清洗消毒之后，投入使用之前，都应进行鸡舍内环境的净化程度检测，以确保鸡舍内环境适合饲养SPF鸡。通常我们是测量鸡舍内0.5～5.0微米的尘埃数。以后我们还要做杂菌计数。
3.2 在SPF鸡的饲养过程中，每周从鸡群中随机抽取1%样品，每只鸡采集3～5ml的血样送实验室检测，每月取5%样品检测，以确保鸡舍的SPF状态。
?总之，二年多来的实践证明，我们SPF鸡场的一整套卫生防疫制度是正确的，是严密的。建立洁净的生物环境是前提，维持洁净的生物环境是关键。只有牢固树立防疫意识，切实做好卫生消毒工作，切断疫病的传播途径，创造洁净的生物环境，保障鸡场的生物安全(BiologicalSecurity)，才是SPF鸡场饲养成败的关键。
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