禽传染性支气管炎疫苗开发所面临的发展与挑战（上）

剪刀客 · 发表于 2019-8-8 20:42:57

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禽传染性支气管炎(IB)是一种分布广泛的家禽疾病，对家禽业造成了巨大的经济影响。新的IBV基因型不断出现和不同IBV基因型之间缺乏交叉保护是IBV疫苗防控中的主要难点。虽然减毒IB活疫苗可有效诱导保护性免疫反应,但毒力返强的潜在风险,母源抗体的中和效应,重组以及突变的发生使得人们使用弱毒疫苗时存在担忧。另一方面,灭活疫苗诱导的免疫反应较弱,可能需要多剂量注射和/或佐剂的使用,存在潜在的安全风险,增加了经济负担。因此,需要寻求其他替代IB疫苗。DNA重组技术的进步使试验性IB疫苗显示出与减毒活疫苗类似的抗体水平和T细胞反应。同时也增强了重组DNA疫苗针对多个血清型的能力，通过载体、纳米佐剂及胚内疫苗免疫方法的应用，其免疫效果得到了改善。尽管大多数IB重组DNA疫苗尚未获得许可,该类型的疫苗可能有望通过诱导多个IBV血清型的交叉保护掌控未来疫苗市场。

1背景

禽传染性支气管炎(IB)是一种重要的家禽疾病，侵害鸡的呼吸道、肾脏和生殖系统，造成经济损失。虽然IB首次发现于美国的NorthDakota,流行病学调查显示，在世界不同地区存在多种IBV血清型。目前,大多数国家都存在经典和变异IBV血清型,从而使IB的控制和预防成为全球挑战。该疾病可造成产蛋下降,增重缓慢,发病率高，从而造成巨大的经济损失。青年鸡感染后死亡率高，尤其是在其他并发症如病毒和细菌感染存在的情况下。

接种疫苗被认为是控制IBV感染最有效的方法。然而,这种方法一直受到若干因素的限制：包括新IBV血清型的出现(目前有超过50种的突变株)，这些血清型之间很少或没有交叉保护。重要的是,一些原本有效的IBV株疫苗可能对新的变异株没有效果,因此需要开发新的疫苗。直到最近,大多数IBV疫苗仍然是基于经典毒株或变异株的减毒活疫苗或灭活疫苗。这些疫苗所使用的毒株来自美国，如M41,Ma5、Ark、Conn，和荷兰,例如,H52和H120,以及欧洲，如793/B，CR88,D274。然而研究表明,这些疫苗的免疫效果有时较差，特别是针对当地毒株时更是如此。IB减毒活疫苗也被证明有助于新的致病性IBV突变株的出现。值得注意的是,最初在中国出现的QX-like毒株的地理分布和组织嗜性发生了变化,在亚洲, 俄罗斯和欧洲等地广泛传播，给家禽饲养者造成巨大的经济损失。本文旨在描述与IBV疫苗相关的发展和挑战。并对病毒引起的免疫应答的某些方面进行了讨论。

2综述2.1病原学和基因组特征

禽传染性支气管炎病毒(IBV),与火鸡冠状病毒和白鲸冠状病毒共同属于Nidovirales病毒目，冠状病毒科的Gammacoronavirus。虽然抗原性上有所不同，冠状病毒科的成员,如SARS和MERS，都具有冠状病毒的共同结构蛋白组成。冠状病毒的基因组是由单链有囊膜的RNA组成,大小为27-32kb,是最大的RNA病毒。尤其是IBV，其病毒粒子平均直径为80-120nm，表面有长约20nm的高度糖基化的杆状纤突。IBV基因组中有四个编码不同结构蛋白的基因。纤突蛋白(S),小包膜蛋白(E),基质糖蛋白(M),和核蛋白(N)。结构蛋白基因之间为基因编码的非结构辅助蛋白,顺序从5’端到3’端依次UTR-1a/1ab-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3-UTR-poly(a)。

结构蛋白基因中,S1和N蛋白含有与宿主免疫应答相关的抗原表位(图1)。

（a）

（b）

图1:禽传染性支气管炎病毒Massachusetts 株S1糖蛋白(a)和核蛋白(b)蛋白质三维结构预测。使用网上SWISS 同源结构分析绘制结构。

2.2糖蛋白

S蛋白为高度糖基化的跨膜蛋白,包含1160个氨基酸,大小为150-200kDa。它包含一个裂解信号序列,一个跨膜域和一个短的C端尾部。IBV S蛋白由3400个核苷酸构成，转译后裂解为氨基端的S1(520个氨基酸残基)和羧基端的S2(625个氨基酸残基)。两个糖基化蛋白(S1和S2)固定在S2羧基端的疏水区域附近,可通过弗林蛋白或高尔基氏复合体相关酶裂解。通常,S1糖蛋白在受体结合时发挥作用,而S2则辅助病毒融合。两种S糖蛋白基因中,S1基因是重要的免疫原性组成部分,包含中和抗体的抗原表位。它还通过病毒-细胞和细胞-细胞间相互作用决定了受体结合。

2.3非结构基因编码的3a、3b、5a和5b蛋白

IBV基因组具有两个小的非结构蛋白基因,3和5,分别表达三个(3a、3b和3c[E])和两个(5a和5b)蛋白。与I和II型冠状病毒相比，IBV的3a、3b 5a和5b蛋白显示出独特的序列特征。虽然这些小蛋白质的特定功能仍是未知的，但这些基因被认为与病毒毒力有关。使用反向遗传学研究5a-ns片段的功能发现，ns蛋白和病毒毒力之间可能存在联系,然而,它们对病毒复制的贡献可能不那么大。

2.4基质蛋白

冠状病毒基质蛋白(M蛋白)略微突出于表面，大小在220-262个氨基酸之间,在N端区域发生糖基化。虽然2群冠状病毒的成员为O-糖基化,IBV和1群冠状病毒为N端低聚糖分子糖基化。M蛋白糖基化的作用还不清楚,然而,以MHV为模型进行研究发现,与感染含有O-糖基化M蛋白的MHV的细胞相比，感染含有N-糖基化M蛋白的MHV可以诱导更好的干扰素反应,而感染含有未糖基化M蛋白的MHV的细胞所诱导的干扰素反应相当低。

2.5核衣壳蛋白

在病毒复制中,N蛋白与M蛋白、N蛋白与nsp3a蛋白之间存在直接作用。同样,因为S片段与M片段之间的相互作用，N蛋白与S蛋白之间存在间接作用。核蛋白与基因组gRNA功能性结合，形成螺旋核糖核蛋白复合物(RNPC),从而协助复制过程中病毒基因组的转录、复制、翻译和包装。由于在羧基端存在CTL抗原诱导表位，冠状病毒N蛋白还可以在诱导细胞毒性T淋巴细胞反应中发挥作用。此外,在核衣壳蛋白N端区域已经发现了新的B细胞线性表位肽。

2.6小包膜蛋白

IBV小包膜“E”蛋白是由高度疏水N端跨膜区和C端胞质区组成的。这种蛋白质被认为与病毒囊膜形成、组装、出芽、离子通道活动和细胞凋亡有关。

2.7血清型和毒株的变化

目前,在不同的国家分布着多种经典和突变IBV毒株。如系统进化树所示，这些毒株的亲缘关系或近或远(图2)。仅5%S1蛋白氨基酸组成的变化就可能导致变异株的出现，并导致密切相关的血清型之间的交叉保护的变化。因此,在设计新的控制策略时必须考虑到IBV-S1序列的性质。尽管IBV首次发现于美国,经典的M41血清型和荷兰H120血清型是最广泛使用的疫苗病毒株。然而,世界动物卫生组织(OIE)建议，不同地理区域IBV血清型的分布也不同，应根据当地情况选择疫苗。例如,M41、Arkansas和Connecticut在美国很普遍,而4/91(793/B,CR88)和D274主要发现于欧洲。最近,中国出现的QX突变株造成了欧洲,亚洲,中东,和非洲的疫情,显示出QX-like基因型毒株的地理分布转移和重要性。地理分布的变化的确是IBV控制计划所面临的一个挑战。预计由于病毒RNA的突变和重组，其他血清型毒株将继续出现，并造成病毒选择压力。其他一些突变株在特定国家和/或地区很常见,但并未确定其在全球的分布情况。

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图2: 显示经典(粉红色)和突变(蓝色)IBV毒株S1 -糖蛋白关系的Neighbour-joining系统进化树。使用1000–bootstrap方法对进化树进行可靠性评估，分支置信度在91.7-100%之间，两个群之间的成对比较相似度为82%。使用Geneious软件R8版本进行系统发育分析。

2.8RNA突变和重组
突变和重组现象是冠状病毒基因组的重要特征之一。与大多数RNA病毒一样,突变和重组是改变或形成冠状病毒病毒基因组的两个重要因素。因此,由于这些重要的基因事件的发生，病毒亚群可能会发生进化。尽管很难确定IBV基因组是如何进化的,有三个主要的理论假设，如下:（i）RNA聚合酶校对机制的缺乏可能导致RNA基因组中的错误，进而导致突变，尤其是S1基因(核苷酸插入、缺失或点突变)。(ii)疫苗，特别是减毒活疫苗的使用，或存在多个不同IBV血清型共同感染，会导致重组的发生,有利于新的IBV突变株的出现。同一冠状病毒毒株的不同基因突变体之间的混合已被证明可以产生准种病毒。在S1基因高变区的突变可能影响病毒亚群，并导致具有不同致病性和毒力的新病毒株的出现。研究发现，编码非结构蛋白2,3和16,以及S1糖蛋白的基因区域重组的程度最高。同样实验证明,在其他免疫抑制病毒，如马立克氏病病毒、鸡传染性贫血病毒和传染性法氏囊病毒存在的情况下对IBV进行传代，会影响IBV的演化。