禽支原体病的诊断

斌哥哥 · 发表于 2008-5-11 18:12:40

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1．禽支原体的分离和鉴定

(1)常用培养基

液体增菌培养基

         鸡肉浸出汤             850ml

         鸡、马或猪血清          150ml

         葡萄糖                10g

         酵母浸膏                10g

         青霉素G钾             100万单位

         10％醋酸铊溶液          2.5～5ml

         酚红                   25mg

调pH至7.8，0.23mg滤腊过滤除菌。

若培养滑液支原体，在上述培养基中加盐酸半胱氨酸0.1g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)0.1g。

固体培养基：上述成份中猪血清、盐酸半胱氨酸、NAD和青霉素0．22μrn过滤除菌，其余成分加1％优质琼脂，加热融化混匀后调pH至7.8，高压灭菌(121C)，凉至50℃时，

将预热至50℃的滤过除菌成份加入，混匀后立即分装平皿或斜面。

(2)采样和分离培养  在感染的急性期(直到感染后60～90天)内上呼吸道支原体含量最高，可采5～10个气管或鼻孔裂隙样品，有气囊炎和滑液囊炎时可采病变部位样品，鸡胚采样应包括卵黄和部份卵黄囊。样品在较远距离运输到实验室之前应在现场接种肉汤培养基。

接处样品的肉汤培养基在37℃培养5～7天，如不见明显生长(培养基变黄)，应盲传2～3次，每次取0.5～1.0ml培养液移种到新的培养基中，这样可提高分离率。将已有支原体生长的培养液接种到固体培养基上，置37℃高湿度空气条件下培养3～5天。如有鸡-毒支原体生长，可见细小(直径0.2～0.3mm)、光滑、园形、透明的菌落，带有特征性的致密突起的中心点，在放大镜或低倍显微镜下观察，如乳头状。选择单个菌落移植新的培养基上，可得到纯培养。

(3)支原体的鉴定  根据菌落的特征和姬姆萨氏染色，菌体为细小和多形性，可作出初步鉴定。支原体最常用的鉴定方法是生长抑制试验。将被检菌株的对数期液体培养物作  10-1、10-2,、10-3稀释，每个稀释度涂布2个平板，在超净台内留置2～3h，使过多的水分蒸发掉；然后将会有抗血清的滤纸片平放在已接种的琼脂平板上，置37℃湿润空气中培养  3～5天；若滤纸片周围出现大于lm的抑菌圈，则判为阳性，税明被检菌株是鸡毒支原体。

支原体鉴定还可采用7日龄SPF鸡胚卵黄囊接处法。鸡毒支原体接种后5～7天引起鸡胚死亡并产生特征性病变，即鸡胚呼吸道有干酪样渗出物；肝脾肿大，心包炎，或全身水肿及肝脏坏死等，多次继代后病变更为明显。死亡的鸡胚液可通过HA和HI试验鉴定。

2．鸡支原体病的检疫  全血平板凝集反应

(1)试验材料  全血平板凝集反应用鸡支原体病检疫用染色抗原，阳性对照血清，玻璃或白瓷反应板，注射器和针头等其他器具。

(2)将抗原充分摇匀后用带针头注射器吸取，在反应板的编号区划内滴2滴，约0.05ml；用带针头的注射器刺破待检鸡的翅静脉，吸少量血滴在同一区划内抗原的边缘，用牙签将血滴与抗原搅拌混合涂成直径约1.5～2.0cm的液面，轻轻摇动反应板，经l～2min判定。试验设阳性血清和抗原对照(抗原1滴加生理盐水1滴)。如待检物是血清，则1滴抗原加1滴血清，搅拌后经30s至lmin判定。

(3)抗原在与血滴搅拌后1～2min呈现紫色大的凝块，红细胞在液面下沉，则为强阳性，记号为“+++—++++”呈现较小的凝集块，或在液面呈大小不均的颗粒状凝集物，则为阳性，记号为“++”；菌体呈小颗粒状，多在液面边缘部分出现，则为可疑，记号为“+”；液面呈紫色混浊，菌体和红细胞逐渐下沉，或仅在边缘部分出现紫色色带，则为阴性，记号为“一”。试验中抗原和生理盐水混和后应无自凝作用，阳性对照血清的反应为“卅—卅”，试验在15～25℃条件下进行。