鸡新城疫弱毒苗、灭活油乳剂苗的制作与应用

少林寺

1、从健康种鸡场挑选无母源抗体的新鲜种蛋，经清洗消毒后，在适宜条件下孵化9~10天。
2、接种前照蛋，画好气室和接种部位。
3、将毒种作1：100稀释，接种9~11日的鸡胚尿囊腔，用一个锥子在酒精灯火焰上烧灼消毒后，从气室顶端蛋壳消毒处钻一小孔，针头从小孔处插入，深约半寸，即已穿过了外壳膜且距胚胎有半指距离，每胚0.1ml，封闭接种孔，继续孵化。每天照蛋2次。可用照蛋灯或显微镜灯在暗室观察,有鸡胚但鸡胚固定一处不动且血管消散呈暗红色者是死胚。活的鸡胚，血管及其主要分枝均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。
4、取出死亡的鸡胚，置4~8℃冷却，并比较不同冷却时间对收毒时滴度、质量的影响。可用HA来鉴定。
5、对气室部位用5%碘酒消毒，然后以无菌剥除气室部位的蛋壳，揭去蛋壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，吸出胚液，若干胚的胚液混为一组，置于灭菌瓶中。
附：血球凝集（HA）试验。
1、原理：鸡新城疫病毒能使鸡或其它动物的红细胞发生凝集反应，因此，可采用HA试验检测具有血凝性的病毒。HA试验主要用于新城疫病毒的常规检测（确定血凝、测定血凝效价）和确定HI试验时病毒的血凝单位。
2.1材料
(2.1.1)被检材料：病料
(2.1.2)0.85%生理盐水
(2.1.3)1%或0.5%鸡红细胞
2.2 操作
HA试验有试管法和微量法，其中微量法是在96孔微量血凝反应板上进行，由于其用量少，操作便利，目前使用较为普便。
（1）用25ul（50ul亦可，原则是试验各步骤加量应保持一致）微量移液管（玻璃滴管可稀释板均可），在“U”或“V”型96孔微量血凝板上加入0.85%生理盐水。
（2）取25ul被检病毒液，从第一孔开始依次作倍比稀释，至第11孔，弃去微量移液管中的液体，第12孔作为不加病毒的红细胞对照孔。
（3）每孔加入1%或0.5红细胞悬液25ul，立即在微量振荡器上摇匀，置室温30min左右观察结果。
（4）以鸡红细胞凝集50%的稀释度，判定为该待检样品的血凝价。
红细胞悬液的制备
需采取至少三只非免疫鸡的红细胞，混匀使用，若采集的是免疫鸡的红细胞必须进行多次反复洗涤。采血可用4%柠檬酸钠（4体积血+1体积4%柠檬酸钠抗凝。事先将抗凝剂装入抽血注射器中，与血轻轻混匀，慢慢倒入刻度锥形离心管中，加入一定量0.85%生理盐水，悬浮红细胞后，再离心，如此重复洗涤红细胞3~5次，最后弃掉上清液，按红细胞的压积用生理盐水配成1%或0.85%的红细胞胞悬液。
（二）抗原灭活和半成品检验
灭活是指用某些理化方法破坏微生物的生物学活性，破坏病原微生物的繁殖能力及致病性，保留其免疫原性。在本实验中，于鸡胚液中加入0.1%甲醛，充分摇匀后于37℃灭活16h，其间摇3~5次。并用血球凝集试验测定灭活前后抗原滴度的变化。通过接种鸡胚的方法，了解灭活是否完全。
（三）佐剂的配制及终产品的完成
佐剂是指单独使用时没有免疫原性，与抗原物质合并使用时，能非特异性的增强抗原物质的免疫原性，增强机体的免疫应答，或者改变机体免疫应答类型的物质。本实验中油相的配制为用92%7号白油或10号白油加入6%司本80和2%硬脂酸铝，经高压灭菌20min即可。将灭的鸡胚液加2%~4%吐温—80作为水相，以1：1~1：2比例缓慢加入油相中，边加边搅拌，制成油包水乳剂苗。灭活苗的无菌检查可通过接种细菌培养基和小鼠来判定。本实验所做疫苗为乳白色乳剂，应避光保存于阴暗处，2~8℃保存期为1年，本疫苗可用皮下接种法进行免疫接