副猪嗜血杆菌病的危害及综合防控措施

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   副猪嗜血杆菌病又称“革拉瑟氏病”，是由副猪嗜血杆菌(HPS)引起的一种以猪多发性浆膜炎、关节炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的传染性疾病。随着规模化、集约化养猪业的发展，副猪嗜血杆菌病由过去散发的传染病变为大面积流行，给养猪业带来了巨大经济损失。我们将从近年来副猪嗜血杆菌病的病原学、流行病学、临床症状与病理变化、分子生物学以及临床诊断和防治等方面的研究进展，进而多方面清晰地认识、了解该疾病发病原因及其产生的危害，并以此为现实生产中副猪嗜血杆菌的治疗和综合防控提供借鉴意义，避免此病的流行和暴发。

一、病原特征

（一）形态学及生理生化特性    1910年，德国科学家 Glasser首次描述了浆液性纤维素性胸膜炎、心包炎以及脑膜炎患猪的浆液性分泌物中，存在一种革兰氏阴性杆菌，但这种病原菌直到1922年才由Sehermer和Ehrlieh首次分离并鉴定。HPS 属于需氧或兼性厌氧菌革兰氏阴性菌，非溶血性、不运动、生长需要特定的V因子(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)[sup] [/sup]，最适生长温度为35℃～37℃，pH 7. 6～7.8。在显微镜下呈多形态，新分离的菌株呈球杆状、双球状或短链状，在陈旧培养物中呈长杆状和丝状。HPS通常有荚膜，但体外培养时易受影响，可变为无荚膜菌。脲酶和氧化酶试验阴性，接触酶试验阳性，可发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麦芽糖等。Morozumi和Hiramune等研究了不同温度条件下HPS在生理盐水和PBS（磷酸盐缓冲溶液）中的存活能力，当HPS存在于生理盐水或PBS中42℃1h、37℃2 h、25℃8h，均检测不到HPS活菌。由此看来，HPS生长条件要求苛刻并且分离困难，在外界环境中的死亡速度非常快，因此对该菌培养和保存的要求非常高，这给研究者带来极大的困难。

（二）流行病学副猪嗜血杆菌是常规饲养猪群上呼吸道的一种常在菌，可在鼻腔、扁桃体和气管前段分离到，而不见任何临床症状。当环境发生变化时或引起免疫抑制的因素存在时，会侵入机体并引起严重的全身性疾病。本病的主要传染源为病猪、临床康复的猪和隐性感染猪；主要的传播途径为呼吸道和消化道，即病菌通过飞沫随呼吸运动而进入健康的仔猪体内，或通过污染饲料和饮水而经消化道侵入体内，在机体抗病力降低的情况下，繁殖、产毒和致病。HPS有很强的宿主特异性，只感染猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，感染高峰通常见于保育期的4~6周，发病率可达40%，严重时死亡率可达50%。

        HPS常与猪的几种重要病原体如猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒引起混合感染。周小兵等(2006)研究结果表明，保育舍内流行猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒时，副猪嗜血杆菌导致的死亡率会增高，即猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒的感染会破坏肺泡巨噬细胞，还会引起鼻腔黏膜炎症,从而破坏非特异性呼吸道防御机制，因而使猪容易发生继发性感染。HPS一年四季均可发病，但有研究表明冬季HPS的感染率和致死率都远远大于夏季，这是由于冬季寒冷的气候对免疫系统影响较大，致使猪只对HPS的抵抗力降低。另有报道，本病的发生常与长途运输、疲劳和其他应激因素等诱因有关。

二、分子生物学

（一）分型 虽然研究HPS病原菌流行病学对于该疾病的防治具有重要意义，但是HPS病原菌通常有较多种系遗传变异，因此对病原菌的鉴定和分型就变得更为迫切，因此精确确定其流行病学的特征，可为疾病的诊断和防治提供准确的理论依据。目前，HPS分型方法包括血清型和基因型。

         副猪嗜血杆菌的血清型复杂多样，按琼脂扩散血清分型方法(KRG)，可将副猪嗜血杆菌分为1～1

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个血清型（国际公认的血清分型标准菌株）。在全世界范围内，各国流行的血清型不尽相同，我国分离株主要是血清4、 5、12、13型，在日~本和澳大利亚广泛流行的血清型为5型，而危害美国猪场的HPS血清型为4型。在鉴定的15个血清型中毒力存在明显的差别，血清型 1、5、10、12、13、14型毒力最强，患猪在4内归于死亡或处于濒死状态；血清2、4、15型为中等毒力，患猪通常不死亡但出现多发性浆膜炎；血清 3、6、7、8、9、11型感染猪后没有明显的临床症状，这些菌株归类为无毒力菌株。另有20%以上的分离株血清型不可定。这可能是由于一些分离株不能表达足够多的特异性，或者可能还存在另外的一些血清型。
        基因分型方法克服了血清学分型的局限性，且灵敏度高，操作简单，为HPS流行病学研究、菌株鉴定，以及了解散发及流行规律、致病机制等方面提供了有力的研究手段。基因分型包括MEE，REF，ERIC等技术。Blackall等1997年用多位点酶电泳(MEE)研究了40个澳大利亚HPS分离株及8个血清型的过氧化氢酶等17种酶的电泳图谱，获得了34种电泳型，经聚类分析，除一个分离株的过氧化氢酶电泳酶谱呈现单一条带外(代表了一个种或亚种)，其余的33种电泳酶谱聚类为两组：第一组包括40个分离株中的血清型4、5 型、部分13型、2个不能分型的菌株，以及2个血清5型的标准菌株；第二组中的血清型范围较广，包括40个菌株中的血清1、2、7、9、10 型和部分13型，以及标准株的1、2、3、4、8、9型。结果表明HPS 的遗传差异性很大，菌群中不止一个种或亚种，而且同一血清型菌株的电泳酶谱不定相同(如血清13 型分离株)。该研究证实了不同的HPS之间存在着多态性。Smart等运用限制性核酸内切酶指纹(REF)技术研究HPS在SPF猪和常规饲养猪的流行与分布，发现大多SPF猪带有相同REF的HPS，而常规饲养猪带菌的REF则存在很大差异，仅有一个菌株为所有试验猪共有。在感染了地方性动物传染病的猪群中，患病猪系统组织的HPS分离株的REF指纹相似性程度很高，这些研究结果显示REF可以作为一种非常有效的分型手段。重复序列PCR（rep- PCR）也是一种研究的流行病学的有效手段，Rafiee等2000年用肠杆菌科基因间重复一致序列（ERIC）-PCR技术研究了HPS的15种血清型， 澳大利亚的14个分离株：3个突发HPS传染病猪群的12个分离株以及2个其他猪场分离株的ERIC—PCR 指纹。结果显示：15种血清型均呈现了唯一独特的ERIC-PCR指纹，且重复性高；3个突发HPS传染病猪群的12个分离株拥有共同的ERIC-PCR 指纹，并且明显不同于15种血清型和来自其他猪场的2个分离株的ERIC-PCR指纹，表明3个猪场HPS病的暴发来自同一病原菌在比较和描述菌株特性方面，较血清学方法更有效。
（二）致病机理及毒力因子  副猪嗜血杆菌感染后侵入全身的机理还不清楚。Miniats研究表明，免疫动物的抗体主要针对外膜蛋白（OMP），OMP有很强的免疫原性。Ruiz等 2001年通过分析从健康仔猪与患病猪分离的HPS OMP也表明外膜蛋白与HPS的毒力有确切关系。但OMP是否是主要的免疫原尚需进一步研究。另外，神经氨酸酶是巴斯德菌科细菌的一种潜在毒力因子，该酶可通过清除宿主细胞的碳水化合物，从而发挥细菌毒力。除了对营养方面的影响以外，神经氨酸酶还介导清除与宿主细胞糖原结合的唾液酸，从而暴露出细菌定居或侵入宿主细胞所需的受体，并通过降低黏蛋白的粘性来干扰宿主的防御系统。Lichtensteiger 等(1997)研究结果显示，90%以上的田间分离株有神经氨酸酶，由此推断神经氨酸酶也可能为HPS的一个毒力因子。铁是细菌生长不可缺少的元素，但是由于宿主糖蛋白、转铁蛋白和乳铁蛋白的络合作用，细菌外环境的铁含量很少。Charlnad等(1995)的研究结果证明，猪血清中存在转铁蛋白受体，HPS利用自身的转铁结合蛋白（tbp）提供生长必需的铁离子，推断tbp在HPS感染宿主动物引起发病过程中起重要作用。还有研究表明Fhu蛋白也是体液免疫反应的目标之一，且表达水平并不受铁的供应情况的限制，由此推断Fhu蛋白也是副猪嗜血杆菌的毒力因子之一。这些研究结果拓展了研究者对HPS 病原本质更深入的认识，为今后该疾病的诊断和药物治疗新靶点开发新型疫苗提供了可能性。
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临床症状及病理变化
（一）临床症状  2～8周龄仔猪感染发病可呈典型症状，育肥猪感染多见慢性经过，哺乳母猪也可感染发病。在临床上常见以下两种病症：急性型：许多猪只突然同时发病，往往首先发生于膘情良好的猪，体温40.5℃～42 ℃，食欲下降或不食，并伴有咳嗽、呼吸困难等症状。鼻孔有粘液性及浆液性分泌物。关节肿胀、跛行、步态僵硬，同时出现身体颤抖，共济失调，可视黏膜发绀，在1～4 d内死亡。个别猪只不表现任何症状而突然死亡，也有的转化为亚急性或慢性型。亚急性型和慢性型：常由急性型转化而来，病猪表现被毛粗乱，反复发热，咳嗽、呼吸困难、耳边缘发紫。有的腹下和四肢末梢等皮肤有紫红色斑块，体表发绀，常见眼睑、耳翼浮肿，跛行和呈犬坐姿势或不爱运动。
（二）剖检变化  剖检特征主要表现为浆液性、纤维素性多发性浆膜炎和多发性关节炎，胸腔内有大量的淡红色液体及纤维素性渗出物凝块。肺表面覆盖有大量的纤维素性渗出物并与胸壁粘连，多数为间质性肺炎，部分有对称性肉样变化，肺水肿、腹膜炎，常表现为化脓性或纤维性腹膜炎，腹腔积液或与内脏器官粘连；心包炎、心包积液，心包内常有奶酪样甚至豆腐渣样渗出物，使外膜与心脏粘连在一起，形成“绒毛心”，心肌有出血点；全身淋巴结肿大，呈暗红色，切面呈大理石样花纹；脾脏肿大，有出血性梗死；关节肿大，关节腔有浆液性渗出性炎症。
（三）病理组织学观察  气管以及肺支气管可观察到的黏膜上皮脱落，黏膜下水肿伴有出血, 中性粒细胞浸润，同样的病变也可在小肠和大肠中观察到。另外，在小肠中还有大量的酸性粒细胞侵润；在心脏、脾脏以及大脑中也可发现有中性粒细胞侵润；在心脏中还可观察到部分心肌纤维断裂，有的心肌细胞发生颗粒变性或水泡变性。肝脏呈灶状坏死，有的肝细胞肿大，灶状坏死同样见于大脑和肾脏中，在大脑中坏死灶周围的神经原细胞严重肿胀，胶质细胞增生，出现卫星现象和嗜神经原现象。
四诊断与防治
（一）诊断   通过病史调查、流行病学、临床症状及剖检变化等可做出初步诊断，确诊还需要进一步实验室检验。首先，采取病死猪的肺、心血、肝、肾、淋巴结及腹水、胸水等病料进行分离、培养、鉴定病原。本菌不发生溶血现象，并进一步进行生化鉴定，本菌可分解蔗糖和尿素，不分解乳糖、甘露醇和麦芽糖，对葡萄糖发酵不稳定；醋酸铅试验呈阴性，硝酸盐还原试验呈阳性。通过血清学诊断方法，如琼脂扩散试验、补体结合试验和间接血凝试验，具有反应灵敏、方便快捷的特点，适合于临床应用。血清学检测可作为猪群感染与否的诊断，但不能确诊猪群是否发病。因为多数猪群中都具有抗副猪嗜血杆菌的抗体，但抗体滴度较低，均不表现临床症状。此病确诊还需借助聚合酶链式反应(PCR)，该技术可大大提高副猪嗜血杆菌感染诊断的灵敏性。Blackall用多点酶电泳(MEE)、Smart用内切酶指纹法、Rafiee和Ruiz用PCR法对本菌基因分型，其结果显示该方法对所有的菌株都能作出鉴定。因副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的一种常在菌，常在健康猪的上呼吸道可分离出该菌。临床症状又与猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎、猪丹毒、猪肺疫、仔猪副伤寒及气喘病等相似，且易于这些疫病的混合感染和继发感染。故确诊该病要综合运用上述诊断方法。
（二）预防 副猪嗜血杆菌病的综合预防方案包括免疫接种、药物预防和加强饲养管理。
1．免疫接种。疫苗的使用是预防副猪嗜血杆菌造成损失的最为有效的方法之一，商品苗和自家苗可以防制副猪嗜血杆菌传染病。然而多种血清型和一定量非分型菌株的存在, 影响了灭活疫苗有效的交*保护。Miniats等(1991)以两株高毒力副猪嗜血杆菌所制备的菌苗诱发了可以抵抗同源和异源攻击的交*保护。相反地，低毒力菌株的菌苗只能抵抗同源攻击。因此推断细菌的毒力可能与其免疫保护力呈正相关，但使用活性强毒菌株存在安全等问题。
目前，哈尔滨兽医研究所，正在对HPS灭活疫苗进行研究，对免疫后母猪生产的仔猪ELISA检测结果显示，仔猪特异性抗体水平显

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的高于对照组；并且免疫母猪所产的仔猪被免疫后，攻毒时不产生临床症状或全身性的损害；相反，未免疫母猪所产的仔猪免疫后，攻毒时表现出中枢神经症状和跛行。因此免疫母猪的作用是非常关键。
2．药物预防。万遂如等在实际生产中总结了很有效的药物预防方案，每吨饲料中加入300 g氟苯尼考、200 g阿莫西林，连续喂14 d。妊娠母猪每吨饲粮中加入利高霉素1 kg，阿莫西林200 g，分娩前后各喂7 d。哺乳仔猪分别在1日龄、7日龄肌肉注射头孢噻呋0.2 ml，21日龄注射0.4 ml。仔猪每吨饲粮中加入80%支原净100 g、强力霉素150 g，于断奶前后各喂7 d，同时配合每吨水中加阿莫西林150 g，连饮14 d。另外可在饮水中加一些抗应激的药物如维生素C等，可以增强预防效果，可有效防止本病的发生。
（三）治疗  发生疫情时，要及时隔离病猪，病死猪作无害化处理，控制好传染源，以免疫情扩散。在发病初期采取非肠道给药途径对整个猪群用大量抗菌素进行预防，对有临床症状的猪只要适当加大用量，以保证药物及时渗透到脑脊髓液及关节中。可选用头孢氨苄、阿莫西林、氨苄西林等抗菌药每隔6～8 h进行肌肉注射，并配合地塞米松增强效果。但由于副猪嗜血杆菌的血清型多，且不同菌株的抗药性不同，所以最好对引起病症的病原体做药物敏感试验，采用敏感药物可以快速有效的控制疫病在猪群中蔓延，而且可以避免盲目用药引起的细菌变异以及经济损失。另外，猪场要按照科学的免疫程序做好猪瘟、伪狂犬病、蓝耳病、猪肺疫、猪丹毒、猪传染性胸膜肺炎及气喘病等疫病的免疫接种，使猪群常年处于良好的免疫状态，也可有效地防止副猪嗜血杆菌病在猪场的继发感染。
五、展望
        目前，副猪嗜血杆菌感染已由原先的零星散发变为大规模的暴发流行，对养猪业的危害正日益加重。随着副猪嗜血杆菌的诊断，流行病学等方面已取得了重大成就，研究者可以快速，准确的掌握特定猪场中病原的流行病学等相关信息，但是HPS是一种机会致病菌，只在与其他病毒或细菌协同时才会致病，因此制定必要的免疫接种、药物预防同时还要配合以优良的管理措施, 防控其他病原体，完全可以预防猪群感染副猪嗜血杆菌在猪场中的广泛流行。今后，在确定毒力因子、阐述其致病机理以及获得保护性免疫的机制、以及研制广谱的疫苗等方面都还需要研究工作者进行深入研究。
参考文献（略）