猪瘟诊断技术的应用进展

猪年

    猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病。近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化，影响了养猪业的发展。牛病毒性腹泻病病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)同属于瘟病毒属，且与CSFV存在血清学交*反应，对猪瘟的诊断造成了干扰。此外，猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的大规模应用，也给CSFV野毒感染猪和疫苗感染猪的鉴别诊断带来较大困难。目前我国对猪瘟的诊断方法有多种，包括病毒病原检测、抗体检测和分子生物学检测三大类。本文简要介绍了几种猪瘟病毒诊断技术。
一、             病原学检测
（一）病毒分离与鉴定病毒分离与鉴定是诊断病毒性疾病最为经典和可靠的方法。取病变组织（扁桃体、脾脏、淋巴结等）研磨成乳液，离心、过滤后，接种于PK-15或猪睾丸细胞培养，CSFV不产生细胞病变效应(CPE)，接毒48～72h后，用冷丙酮固定，进行免疫荧光或免疫酶染色，镜检。也可将病毒回归到健康动物体内，出现猪瘟的典型症状即可确诊。
（二）猪瘟兔体免疫交互试验猪瘟强毒不引起家兔体温反应，但能使其产生免疫力，猪瘟兔化弱毒(HCLV)能使家兔产生定型热反应，但对已产生免疫力的家兔则不产生体温反应。利用这一原理，将病料无菌处理后接种健康家兔，同时设注射生理盐水对照组。7 d后用HCLV静脉注射，每6 h测温1次，连续3d。若对照兔发生定型热反应，说明试验成立，可分析判定结果；若试验组体温反应正常，则说明含有猪瘟病毒；若体温反应成定型热，则说明不含有猪瘟病毒。

（三）免疫荧光抗体试验(FA)直接荧光抗体试验作为猪瘟的法定诊断方法在许多国家和地区均已实行。采取CSF的病料或组织培养物，制备冰冻切片或触片，丙酮固定后用猪瘟荧光抗体染色检查，出现绿色荧光为阳性，否则为阴性。何若钢等利用荧光抗体技术对广西十几个猪场进行猪瘟调查，结果猪瘟阳性率达7.21%，而这些猪均外表健康无任何病症。荧光抗体检测法准确可靠、灵敏度高、特异性强。
（四）鸡新城疫病毒强化试验(END)猪瘟病毒与NDV在猪睾丸细胞上均不产生CPE。在一定条件下，先被CSFV感染的猪睾丸细胞，随后再感染NDV时可产生CPE。这一现象称为新城疫病毒强化试验(END)。具体方法是在猪睾丸细胞培养物中接种无菌处理的被检材料，37℃培养4 d，随后接种10[sup]6[/sup]个蚀斑形成单位的NDV，继续培养3 d。如果细胞出现病变，则表示有CSFV存在。此强化现象可被CSFV的抗血清所抑制，可用于CSFV的中和试验。
二、             血清学检测
    血清学检测通常用于了解猪的群体免疫水平和对疫苗免疫效果进行评价，为预防接种提供科学依据。
（一）猪瘟正向间接血凝试验（IHA ）抗原与相应的抗体在一定条件下结合形成抗原抗体复合物，但一般肉眼看不见这种复合物。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，就能大大提高抗原抗体反应的灵敏性。李树春等用浓缩的HCLV致敏由戊二醛鞣酸处理的绵羊红细胞，当其与相应抗体相遇时，红细胞便出现清晰可见的凝集现象，这就是IHA的原理。本实验室曾用猪瘟IHA试剂盒来检测猪的群体免疫水平，该方法操作简单、重复性好。
（二）中和试验 病毒或毒素与相应的血清抗体结合后，失去了对易感动物或敏感细胞的致病力，这是中和试验的基本原理。
1.兔体中和试验。将HCLV与系列稀释的待检血清中和，接种家兔观察体温变化，以此确定血清的终点滴度。当稀释度大于1:32时，则表明待检血清能够保护猪群免受CSFV感染；当稀释度小于1:32时，应及时对猪群进行免疫接种。
2.荧光抗体病毒中和试验。将待检血清56℃30 min灭活后做适当稀释，与等体积的200 TCID[sub]50[/sub]/0.1 ml的CSFV中和，然后接入PK-15细胞，维持液孵育2 d以上。采用直接免疫荧光方法进行检查，并设立对照组。可发现对照组有翠绿色光斑，而试验组光斑消失。
3.过氧化物酶联中和试验。将待检血清稀释后与200 TCID[sub]50[/sub]/50μl的病毒液中和，然后接入细胞，待细胞长成单层后固定，加入高免猪抗CSFV血清，最后加入辣根过氧化物酶(HRPO)标记的抗猪IgG，作用后加入底物显色，根据颜色就可判定结果。
（三）间接ELISA试验间接ELISA法首先包被抗原，将待检血清稀释后加入孔中，然后加入HRPO标记的葡萄球菌蛋白A或其他可与抗体结合的物质，作用后加入底物显色，酶标仪读数判定结果。根据包被抗原（猪瘟强毒或HCLV）的差异，可用来检测抗猪瘟弱毒或强毒抗体水平。检测猪瘟弱毒抗体效价水平，以此判断免疫接种是否成功及保护率高低，从而确定免疫程序，及时淘汰免疫耐受猪（疫苗接种后不产生或仅产生低水平抗体的猪）；检测猪瘟强毒抗体，可及时淘汰猪群中的隐性带毒者。
三、             分子生物学检测
（一）定性检测技术
1.RT-PCR技术。用RT-PCR技术检测猪瘟病毒在国内外使用的比较普遍。吴鑫等设计了1对针对猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物，能从接种猪瘟F114毒的PK-15细胞总RNA中扩增出目的片段。用建立的RT-PCR方法检测26份疑似猪瘟病料，结果检出阳性病料24份，阳性检出率为92.3%。巢式PCR技术是在RT-PCR基础上，用第二套引物扩增第一次反应生成的PCR产物的亚片段，可使检测结果更具有特异性。魏淑英用建立的巢式PCR对山东某规模化猪场中临床上疑似猪瘟病例的组织进行检测，用一扩引物在305 bp处扩增出目的条带，二扩引物在172bp处扩增出更加明显的目的条带，确诊为猪瘟病毒感染。胡建和等设计了2对分别针对猪瘟强毒株和HCLV的特异性引物。根据3[sup]，[/sup]端引物碱基错配对PCR扩增效率的影响，优化筛选出了能够鉴别HCLV和强毒株的PCR退火温度，经多重试验组合建立了一套鉴别猪瘟强弱毒的多重RT-PCR方法。
2.LAMP检测技术。环介导等温扩增技术（LAMP）是一种在等温条件下，依赖于自动循环的链置换技术，需要针对靶序列上的6个区域设计4条引物，该方法特异性强，灵敏度高，不需要PCR仪，操作简单方便，目前已成为研究的热点。陈蕾等提取猪瘟石门血毒(10[sup]3.84[/sup]TCID[sub]50[/sub])RNA做10[sup]1[/sup]-10[sup]8[/sup]倍梯度稀释，进行RT-LAMP灵敏度试验，结果RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高100倍。Hao tai Chen等针对CSFV的5[sup]，[/sup]-UTR保守序列设计了4条引物，建立了CSFV的RT-LAMP检测方法。该方法不能从PCV2（猪圆环病毒2型）、PPV（猪细小病毒）、PRV（猪伪狂犬病毒）、 PRRSV（猪蓝耳病病毒）、JEV（日~本乙型脑炎病毒)的核酸中扩增出目的片段，能从CSFV-GS 和CSFV-LT株核酸中扩增出阳性片段。用RT-LAMP对临床样品血液、扁桃体、鼻腔或直肠分泌物进行检测，检出率分别为100%, 83% 和72%，表明检测血液和扁桃体的灵敏度要高一些。
（二）定量检测技术
1.实时荧光定量PCR技术（FQ-PCR）。实时荧光定量PCR技术（FQ-PCR技术）在基因表达水平的分析、病原体的定性和定量检测等方面得到了广泛应用。Risatti等用荧光定量RT-PCR对实验感染猪鼻拭子、扁桃体和全血进行了检测，发现该方法的敏感性超过病毒分离，达到1～100 TCID[sub]50[/sub]。赵建军等设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对CSFV石门系强毒株和HCLV的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分CSF强弱毒株的复合实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的CSF强毒株与HCLV完全区分开来，且不与其他猪源病毒发生非特异性反应。
    王荣等建立了检测猪瘟病毒的 SYBR Green I实时定量PCR 方法。SYBR Green I 是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强，且其荧光强度的增加与双链DNA的数量成正比。用该方法检测临床疑似病料，结果表明，建立的HCV SYBR Green IPCR方法特异性强，与FMDV（口蹄疫病毒）、PCV2、PRRSV、PPV、PRV 等常见猪病病原没有交*反应；灵敏度高，可以检测到5.3×10[sup]2[/sup] 的病毒拷贝数；操作简单，耗时短，只需3 h 即可完成整个试验过程。
2.PCR-ELISA。PCR-ELISA是用免疫学方法检测PCR产物，即在PCR扩增后，在微量板上借用ELISA的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。其原理是在进行PCR扩增时一个引物的5[sup]，[/sup]端标记生物素，另一引物则在5[sup]，[/sup]端标记显色基团（如FITC，用HRP标记的抗FITC结合显色），这样PCR产物就可结合到亲和素包被的塑料板上，靶序列被捕获。再在微孔中加入用HRP标记的抗体，抗体与靶序列上的抗原结合，再加入底物使之显色，可进行常规ELISA检测，设计已知标准对照，可进行定量。其过程为：核酸的提取与制备；PCR扩增；微孔预杂交；PCR产物杂交；显色反应；检测分析。该方法的敏感性可与放射性核素标记相比，但又避免了核素的危险。
四、结 语
   我国猪瘟诊断的方法虽多，但是各种技术均存在不同程度的缺点，各方法之间的相关性研究较少，相关方法标准化的制定也十分薄弱。因此，加强猪瘟强弱毒株鉴别检测技术的研究，加强开展抗原、抗体相关检测方法标准化的制定是今后猪瘟检测技术研究的趋势。另外，在猪瘟疫苗的生产过程中，疫苗病毒滴度的确定及其效力检验仍采用兔体测毒法，该方法耗时费力，且兔体个体差异大，无法准确对活体病毒量进行准确标定，因此开发新的方法来替代兔体测毒法也是今后研究的一个方向。