鸡内源性类J亚群禽白血病病毒gp85基因的序列分析

猪年

童淑梅[sup]1[/sup]，杨玉莹[sup]2*[/sup]

(1.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特 010018；2.长江大学，湖北荆州 434025；3.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009)   

摘　要：利用J亚群禽白血病病毒gp85基因两侧的序列为引物，从正常的SPF鸡胚、肉鸡胚、良凤花鸡胚和土鸡的基因组中扩增出完整的内源性类ALV-Jgp85基因序列。这4种不同品种来源的ALV-Jgp85基因与已报道的DF1细胞的内源性类ALV-Jgp85基因的同源性依次为98.5%、96.7%、98.6%和95.2%；与ALV-J原型株HPRS-103的同源性依次为97.3%、95.2%、97.6%和94.9%；与外源性IMC株的同源性依次为90.4%、88.5%、90.7%和89.6%。这将为深入探讨内源性类gp85基因在感染ALV-J发病的过程中起何种作用奠定了基础。
关键词：内源性类ALV-Jgp85基因；序列分析；基因的同源性
J亚群禽白血病是由J亚群白血病病毒(J subgroup avian  leucosis virus，ALV-J)引起的主要侵害肉鸡的一种肿瘤性疾病。1991年Payne在肉种鸡中首次发现此病。ALV-J的env与其他外源性亚群A～D的env基因只有40%的同源性，而与内源性病毒EAV-0有75%～97%的同源性。这种与内源性类env的高度同源性使得有理由相信，ALV-J涉及与内源性类env基因间的重组。由于诱发肿瘤、患鸡胴体废弃、产蛋性能下降和对鸡群其他未知的影响，ALV-J给养禽业带来巨大经济损失和严重威胁，已引起众多学者的重视。野外调查和实验室研究表明，J亚群ALV比其他外源性亚群ALV有更快更强的水平传播能力；在肉鸡和蛋鸡鸡胚9日龄～11日龄免疫功能尚不健全时感染ALV-J，与其他亚群一样容易导致免疫耐受，形成病毒血症而无抗体免疫应答。然而，出壳化后早期感染ALV-J，肉鸡和蛋鸡却表现出明显不同的两种反应。多数品系的蛋鸡能够产生中和抗体中和病毒，表现为一过性病毒血症；而所有品系的肉鸡感染后有一定数量宿主却没有产生中和抗体，呈现持续性病毒血症[sup][1][/sup]。禽内源性反录病毒EAV-HP(或称为ev/J ) 是近年来发现的内源性禽反录病毒(Endogenous avian ret rovirus，EAV) EAV-0 的新成员[sup][2-3][/sup]。既然J 亚[CM22－22]群ALV的囊膜蛋白基因与EAV-HP env基因有
97%以上的同源性，相信这种宿主ALV-J 的免疫耐受现象与胚胎时期内源性EAV-HP 的env基因低水平表达有关[sup][4][/sup]。本研究对SPF鸡胚、肉鸡胚、良凤花鸡胚和土鸡的基因组中存在的内源性类ALV-Jgp85基因进行了扩增与序列分析。
1　材料与方法
1.1　非ALV-J感染鸡的选择
本研究中所用的SPF鸡胚、肉鸡胚、良凤花鸡胚和土鸡均经ALV-J ELISA抗体检测、ALV-J ELISA抗原检测和ALV-J特异性引物进行PCR扩增均呈阴性后，作为基因组提取的样品。
1.2　基因组DNA的提取
基因组DNA的提取按分子克隆实验手册的方法[sup][5][/sup]进行。  
1.3 PCR扩增内源性类ALV-J gp85基因
采用ALV-J gp85基因两侧序列片段为引物，正向引物为5′-CTG GAT CCA  TGG GAG TTC  ATC TAT  TGC AAC ACC  CAG，含BamHⅠ酶切位点；反向引物为5′-TAC TGC AGT  TAG CGC CTG  CTA CGG  TGG TGA CC，含pstⅠ酶切位点。50 μL体系的PCR反应的组成是：10×Taq buffer 5 μL，2.5  mmol/L dntp 4 μL，25  p正反向引物各1  μL，模板1  μL，TaKaRa Taq0.5  μL。PCR反应条件为94  ℃预变性5 min，再进行94  ℃ 1 min，58  ℃ 1 min，72  ℃ 1 min 30 s的33次循环，72  ℃10 min延长。ALV-J的特异性引物H5/H7，位于pol基因和env基因，正向引物H5为5′-GGA TGA GGT  GAC TAA GAA  AG(5 258～5 277)，反向引物H7为5′-CGA ACC AAA  GGT AAC ACA  CG(5 783～5 802)，PCR反应条件同上。
1.4 DNA电泳及目的片段的纯化
电泳方法按分子克隆实验手册[sup][5][/sup]进行，DNA片段的纯化采用Qiagen试剂盒纯化，从琼脂糖凝胶中抽提的具体步骤按产品说明书进行。
1.5 PCR产物与载体质粒DNA连接反应
DNA连接反应的组成是1  μL pGEM-T Easy  Vector，5  μL 2×buffer，1  μL T[sub]4[/sub]DNA  ligase，3  μL纯化的DNA目的片段，连接反应条件为4  ℃反应16 h～24  h。  
1.6　细菌转化及酶切鉴定
采用CaCl[sub]2[/sub]法制备DH5α感受态细胞。连接产物转化DH5α细胞及碱裂解法小量提取质粒DNA参照分子克隆实验指南[sup][6][/sup]进行。提取的重组质粒DNA进行BamHⅠ/pstⅠ双酶切鉴定。
1.7 DNA的序列测定与比较
将正确的重组质粒以菌液的形式直接送上海生物工程技术有限公司测序，用DNAstar核酸分析软件分析测序结果。
2　结果
2.1　预选样品
经ALV-JELISA抗体检测、ALV-J ELISA抗原检测、ALV-J特异性引物进行PCR扩增均呈阴性的SPF鸡胚、肉鸡胚(MTC)、良凤花鸡胚(LC)和土鸡(TC)各选5只。
2.2　内源性类ALV-J gp85基因的PCR及其特异性PCR
采用ALV-Jgp85基因两侧的序列片段作为引物进行扩增，SPF、MTC、LC和TC均出现一致大小的扩增片段(图1)。采用ALV-J的特异性引物H5/H7进行扩增，其结果4种DNA样品均无阳性扩增(图2和图3)。说明此4个品种的鸡是非ALV-J感染的，扩增出来的片段基因是内源性的而非外源性的。

                                   

1.100  bp DNA标准；2.SPF鸡的基因组；3.MTC的基因组；4.LC的基因组；5.TC的基因组
1.100  bp DNA Marker；2.SPFgenome；3.MTC genome；4.LC  genome；5.TC  genome  

图1 SPF、MTC、LC和TC基因的PCR结果

Fig.1 PCR result of SPF，MTC，LC and TC

                                  

1～3.分别为内源性引物扩增的SPF、MTC、LC的基因组；4.1  kb DNA标准；5～7.分别为外源性ALV-J特异性引物H5/H7扩增的基因组
1-3.SPF，MTC and LC genomes amplified with endogenous primers；4.1  kb DNA  Marker；5-7.SPF，MTC and LC  genomes amplified with  exogenous primers  H5/H7   

图2 SPF、MTC和LC基因的内外源性引物进行PCR 结果

Fig.2 PCR result of using endogenous and exogenous primers to amplify SPF，MTC and LC genomes

                                  

1.100  bp DNA标准；2.内源性引物扩增TC的基因组；3.ALV-J外源性特异性引物H5/H7扩增TC的基因组
1.100  bp DNA Marker；2.TC  genome amplified  with endogenous primers；3.TC genome amplifies  with exogenous primers  H5/H7  

图3 TC基因分别经内、外源性引物进行PCR的结果

Fig.3 PCR result of using endogenous and exogenous primers to amplify TC genome

2.3　内源性类J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与酶切鉴定
将PCR产物在10  g/L琼脂糖凝胶中电泳后，用Qiagen试剂盒对切割下的DNA条带进行纯化，使纯化好的DNA片段溶于25  μL灭菌ddH[sub]2[/sub]O，取其3  μL纯化的DNA片段按3∶1的比率与pGEM-T Easy Vector进行混合，用T[sub]4[/sub]DNA连接酶连接，最后用CaCl[sub]2[/sub]法制备感受态和转化，经小量提取质粒DNA。用EcoRⅠ单酶切重组质粒pGEM-SPFCgp85-Like，电泳结果显示，插入的内性类ALV-Jgp85基因片段的大小与原SPF的PCR扩增片段大小一致(图4)。用BamHⅠ和pstⅠ双酶切分别鉴定重组质粒pGEM-MTCgp85-Like、pGEM-LCgp85-Like、 pGEM-TCgp85-Like和pGEM-SPFCgp85-Like，其结果显示前3个插入的内源性类ALV-Jgp85基因片段的大小分别与原MTC、LC、TC的PCR扩增片段大小均一致(图4和图5)；而pGEM-SPFCgp85-Like经BamHⅠ和pstⅠ双酶切后出现2个基因片段，一个700  bp左右，另一条带250  bp左右的大小(图5)，这说明SPF目的基因内部序列中含有BamHⅠ酶切位点。   

                                

1.1  kb DAN标准；2.pGEM-TCgp85-Like的双酶切结果；3.pGEM-SPFgp85-Like的单酶切结果
1.1  kb DNA Marker；2.BamHⅠ/pstⅠ digestion result  of pGEM-TCgp85-Like；3.EcoRⅠ  digestion result of  pGEM-SPFgp85-Like  

图4 pGEM-TCgp85-Like经BamHⅠ/pstⅠ双酶切、pGEM-SPFgp85-Like经EcoRⅠ单酶切的结果

Fig.4 Enzyme digestion result of pGEM-TCgp85-Like and pGEM-SPFgp85-Like   

                                

1.1  kb DNA标准；2～3.pGEM-MTCgp85-Like的双酶切结果；
4～5.pGEM-LCgp85-Like的双酶切结果；6～7.pGEM-SPFgp85-Like的双酶切结果
1.1  kb DNA Marker；2-3.BamHⅠ/pstⅠ digestion result  of pGEM-MTCCgp85-Like；4-5.BamHⅠ/pstⅠ digestion result  of pGEM-LCgp85-Like；6-7.BamHⅠ/pstⅠ digestion result  of pGEM-SPFgp85-Like  

图5 pGEM-SPFCgp85-Like、pGEM-MTCgp85-Like、pGEM-LCgp85-Like经BamHⅠ/pstⅠ双酶切的结果

Fig.5 BamHⅠ/pstⅠ digestion result of pGEM-SPFCgp85-Like，pGEM-MTCgp85-Like and pGEM-LCgp85-Like

2.4　内源性类ALV-J gp85基因的测序结果
将重组质粒pGEM-SPFCgp85-Like、pGEM-MTCgp85-Like、pGEM-LCgp85-Like和pGEM-TCgp85-Like以菌液的形式送出测序。测序的结果显示SPFCgp85-Like为949  bp(含引物)、MTCgp85-Like为942  bp(含引物)、LCgp85-Like为946  bp(含引物)、TCgp85-Like为916  bp(含引物)。
2.5　内源性类ALV-J gp85基因的序列分析
利用DNAstar对SPFCgp85-Like、MTCgp85-Like、LCgp85-Like、TCgp85-Like与已报道的DF1gp85-Like、ALV-J原型株HPRS-103、IMC[sub]10200[/sub]株的序列进行比较分析，结果只有SPFCgp85-Like中含有BamHⅠ位点，而MTCgp85-Like、LCgp85-Like、TCgp85-Like、DF1gp85-Like、原型株HPRS-103和IMC[sub]10200[/sub]株中均无BamHⅠ和pstⅠ任何一个酶切位点。SPFCgp85-Like、MTCgp85-Like、LCgp85-Like、TCgp85-Like与ALV-J原型株HPRS-103的序列中均于356位～361位缺失6个碱基，于602位～610位缺失9个碱基；MTCgp85-Like的序列于803位～804位缺失2个碱基，于811、817和823位各缺失1个碱基；TCgp85-Like序列于698位～727位缺失30个碱基。这5个不同来源的的内源性类ALV-Jgp85基因的其它位点的碱基序列与外源性ALV-J的原型株HPRS-103、IMC[sub]10200[/sub]株基本上表现为一致的分析结果。
将4个不同来源的的内源性类ALV-Jgp85基因与DF1gp85-Like、ALV-J原型株HPRS-103、IMC[sub]10200[/sub]株的基因的核苷酸序列进行比较分析(表1)，SPFCgp85-Like、MTCgp85-Like、LCgp85-Like、TCgp85-Like与已报道的DF1gp85-Like的同源性依次为98.5%、96.7%、98.6%和95.2%；与ALV-J原型株HPRS-103的同源性依次为97.3%、95.2%、97.6%和94.9%；与外源性IMC株的同源性依次为90.4%、88.5%、90.7%和89.6%。生物进化树分析表明MTC与DF1细胞更加近源；对比外源性IMC[sub]10200[/sub]株，这5个不同来源的的内源性类ALV-Jgp85基因与ALV-J原型株HPRS-103更加近源(图6)。   

表1　内源性类ALV-Jgp85基因与EAV-HP的核甘酸序列的同源性分析

Table 1 Homological analysis of nucleotide sequences of endogenous ALV-Jgp85-like and EAV-HP (Weighted)

 
 
 
 
 
 
 
注：①上三角区表示其同源性的百分比；②下三角区表示其异源性的百分比。
Note：①Percent homology in upper triangle；②Percent heterology in lower triangle.

                                

图6　内源性类ALV-Jgp85基因与EAV-HP的生物进化树分析

Fig.6 Phylogenetic tree of the endogenous ALV-Jgp85-like and EAV-HP

3　讨论
本研究利用PCR的方法对SPF、MTC、LC和TC的内源性类ALV-Jgp85基因进行了扩增，并且成功地克隆进大肠埃希菌内。经过核酸序列测定分析，证明了SPFC、MTC、LC和TC的内源性类ALV-Jgp85基因片段的大小分别为949、942、946、916 bp。无论是SPF鸡胚、肉鸡胚、良凤花鸡胚、地方性土鸡，还是已报道过的DF1传代细胞(由0系来航鸡鸡胚成纤维细胞发展而来)，其基因组DNA均可被扩增外源性ALV-Jgp85基因的引物所扩增，这表明鸡的基因组内存在高度同源的内源性类ALV-Jgp85基因的完整序列。这4种不同来源的实验鸡是经过ALV-JELISA抗体检测、ALV-J ELISA抗原检测、ALV-J特异性引物进行PCR扩增均呈阴性后才进行后的实验工作，保证了内源性类ALV-Jgp85基因序列测定结果的可靠性。
核酸序列分析结果显示，SPFCgp85-Like、MTCgp85-Like、LCgp85-Like和TCgp85-Like与已报道的DF1gp85-Like、ALV-J原型株HPRS-103、IMC[sub]10200[/sub]株的序列比较后同源性很高，而且经过外源性ALV-Jgp85基因的特异性引物H5/H7扩增呈阴性，证明是内源性的基因。
2005年，徐镔蕊用ALV-Jgp85单克隆抗体证明蛋鸡中也会发生J亚群禽白血病[sup][7][/sup]，并且首次从分子水平上证明蛋用型鸡发生J亚群禽白血病[sup][8][/sup]。成子强现已从中国麻鸡中发现禽J亚群白血病[sup][9][/sup]，而且2005年在J亚群禽白血病病理学观察及抗原定位方面做了研究[sup][10][/sup]。2006年，Wang Z等发现在抗体的选择性压力下ALV-Jgp85基因出现了变化[sup][11][/sup]。目前为止，J亚群禽白血病仍然对我国及世界的养禽业造成严重威胁。本试验的研究为更深入地在分子水平上研究J亚群白血病起到了作用。
本研究为将来弄清我国SPF鸡、肉鸡及一些地方性品种的鸡的内源性类ALV-Jgp85基因序列的编码及分子生物学特征，明确它们与国内ALV-J分离毒株间分子生物学共性和差异打下坚实基础。为揭示正常情况下内源性类ALV-Jgp85基因的活性状态，并研究它们与外源性病毒gp85表达物免疫学共性和差异提供了有利条件。
 

参考文献（略）

归海一刀

太专业了看不懂

野鹤闲云

好帖；只是我看了也不能消化多少；待以后慢慢学习。