鸡贫血病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆、原核表达和纯化

猪年

吴艳红[sup]1[/sup]，陈建龙[sup]2[/sup]，李丛丛[sup]1[/sup]，何成强[sup]1[/sup]，李云龙[sup]1[/sup]

(1.山东师范大学生命科学学院动物抗性实验室，山东济南 250014；2.山东省济南第一中学，山东济南 250011)  

摘　要： 根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列，设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物，利用PCR方法从CAV基因组序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp)，按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a(＋)上，得到含VP1大片段的pET32a(＋)重组子，转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导重组蛋白表达，经SDS-PAGE和Western-blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达，与预期分子质量大小一致，通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白，经Western-blotting鉴定，融合蛋白与His单抗能够结合。CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源，也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础。
关键词：鸡贫血病毒；VP1；原核表达
鸡贫血病毒(Chicken anemia virus，CAV)是鸡传染性贫血(Chicken infectious anemia，CIA)的主要病原，属圆环病毒科(Circoviride)[sup][1-2][/sup]，它主要引起感染雏鸡的直接死亡和感染成鸡强烈的免疫抑制。CAV基因组为单股、负链、圆环状、共价连接的DNA病毒，有3个重叠部分的开放读码框，编码3种蛋白，即衣壳蛋白VP1、伴侣蛋白VP2和细胞凋亡素VP3[sup][3][/sup]。其中，VP1是主要的结构蛋白，蛋白分子质量约为51.6 ku，它和VP2共表达能诱发机体产生一定的中和反应性[sup][4][/sup]。但单纯VP1 蛋白在CAV 的复制、对靶细胞的侵染过程以及在机体的抗病毒感染过程中起着哪些具体作用，尚未有定论。要在体外研究其生物学活性，需要大量的VP1蛋白，但CAV在鸡体内和体外特定宿主细胞系内复制量很低，所以选择另一替代途径是非常有意义的。本实验室在获得CAV VP1基因组的基础上，利用大肠埃希菌在体外大量表达VP1蛋白作为替代途径，并且选用pET32a(＋)原核表达载体，由于其有Trx-His标签，便于蛋白的表达和纯化，为后续相关试验奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
pGM-T载体、质粒小量提取试剂盒、DNA回收试剂盒、His单抗和碱性磷酸酶标记的马抗鼠二抗等购自天根生化科技(北京)有限公司；pET32a(＋)、DH5α、BL21和pUC18-CAV克隆质粒由本实验室保存；限制性内切酶EcoR Ⅰ和SalⅠ、TaqDNA聚合酶、λEcoT14 I digest DNA Marker、标准蛋白质分子质量、DNA ligation kit ver 2.0和IPTG、X-Gal等购自Takara公司；用于蛋白纯化的Ni亲和层析树脂购自Novagen公司；Western-blotting检测使用的硝酸纤维素膜和PVDF膜均为Pharmacia公司产品。
1.2　方法
1.2.1 CAV VP1基因大片段的扩增及序列测定　根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列，设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物，上游引物为5′-CCGGAATTCATGGCAAGACGAGCTCGC-3′下游引物为5′-ACGCGTCGACGAACAGGTGCCAGCCC-3′，其中上、下游引物的5′端分别引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，分别为GAATTC和GTCGAC。以本实验室前期构建好并测序正确的的pUC18-CAV为模板PCR扩增目的基因，总反应体积为50 μL，循环参数为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25个循环；72 ℃再延伸5 min～7 min。扩增出目的基因命名为VP1′。PCR结束后，取3 μL在10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，以λEcoT14 I digest DNA Marker为参照，观察扩增片段大小。将PCR扩增产物VP1′克隆入pGM-T载体，EcoRⅠ单酶切鉴定正确后，交由济南博亚生物技术有限公司测序。
1.2.2 CAV VP1′蛋白的原核表达表达载体的构建　以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切测序正确的pGM-T-VP1′，获取VP1基因大片段VP1′，以同样的两种酶切pET32a(＋)载体，分别回收VP1基因大片段VP1′和pET32a(＋)载体片段，16 ℃水浴用 DNA ligation kit连接载体与目的基因30 min，构建VP1′的重组质粒pET32a- VP1′，转化DH5α感受态细胞，用含Amp的LB平板筛选阳性克隆，小量提取质粒EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。酶切后经琼脂糖凝胶电泳，以λEcoT14 Ⅰ digest DNA Marker和DNA Marker Ⅱ为参照，观察酶切片段，验证质粒的正确性。阳性重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，含Amp的LB平板筛选阳性克隆。
1.2.3 Trx-His-VP1′融合蛋白的表达、纯化和检测　以pET32a-VP1′转化BL21感受态细胞，挑取阳性单克隆于2×YT培养基中，37 ℃振摇过夜，按1∶100转接到2×YT培养基中，在一定温度下(28 ℃和37 ℃)振摇3 h以上，使A600约为0.8(0.4～1.0)，取未诱导对照菌后，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG继续培养一段时间后(分别为3、4、5 h)终止培养。同步设立pET32a转化菌为阴性对照。取一定量培养物于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，将菌体悬浮于1×PBS中，用超声波探头进行破碎，超声波的强度以不能产生气泡为宜，破碎的时间根据实际情况掌握，一般是将云雾状的悬浮物破碎至比较清朗即可。5 000 r/min离心10 min，分别取上清和沉淀(包涵体)进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白条带大小，并以未诱导菌和只转化空载体pET32a的BL21菌作为对照。同等条件下大量诱导，收集破碎后用含8 mol/L(pH 7.9)尿素的Binding buffer溶解包涵体，灭菌水、硫酸镍溶液、Bingding buffer依次加入平衡Ni亲和层析树脂并将树脂与Trx-His-VP1′融合蛋白结合，用Elute buffer(pH 7.9)洗脱蛋白。Western-blotting检测纯化蛋白。
2　结果
2.1 CAV VP1基因大片段的扩增及序列结果
CAV VP1基因大片段PCR产物VP1′ 8 g/L琼脂糖凝胶电泳可见608 bp特异性条带(图1)，与预期基因片段大小相当。回收片段后插入pGM-T，形成pGM-T-VP1′，酶切鉴定正确后，送入济南博亚生物技术有限公司序列测定。测序结果与GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列比对无突变。
2.2 CAV VP1′蛋白的原核表达表达载体的构建结果
以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切测序正确的pGM-T-VP1′，获取VP1基因大片段VP1′，以同样的两种酶切pET32a(＋)载体，分别回收VP1基因大片段VP1′和pET32a(＋)载体片段，16 ℃水浴用 DNA ligation kit连接载体与目的基因30 min，构建VP1′的重组质粒pET32a-VP1′，转化BL21感受态细胞，用含Amp的LB平板筛选阳性克隆，之后小量提取质粒EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，得到约5 292 bp和608 bp两个片段，与预期的大小一致(图2)。
2.3 Trx-His-VP1′融合蛋白的表达、纯化和检测结果
将原核表达载体pET32a-VP1′转化到BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导后，可见约42 ku的融合蛋白(图3)。诱导后菌体破碎后分别将沉淀和上清跑SDS-PAGE，发现融合蛋白主要以包涵体形式表达(图4)。用pH为7.9的8 mol/L尿素溶解包涵体，用灭菌水等平衡Ni亲和层析树脂，硫酸镍进行灌镍后将溶解的包涵体与树脂结合，用Elute buffer洗脱蛋白，得到分子质量约为42 ku的融合蛋白，而转化 pET32a空载体的BL21仅表达20 ku左右的Trx-His标签蛋白(图4)，以anti-His为一抗做Western-blotting，可检测到纯化出的融合蛋白(图5)。

                               

M.λEcoT14 I digest DNA标准；1～2.CAV VP1基因大片段的PCR产物VP1′
M.λEcoT14 I digest DNA Marker；1-2.The PCR product VP1′ of the large fragment of CAV VP1

图1 CAV VP1基因大片段的克隆

Fig.1 Cloning of large fragment of CAV VP1

                                 

M1.DNA标准Ⅱ；M2.λEcoT14 Ⅰ digest DNA标准；
1.pET32a经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切；2～3.pET32a-VP1′经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定；4～5.pET32a-VP1′质粒
M1.DNA Marker Ⅱ；M2.λEcoT14 Ⅰ digest DNA Marker；1.pET32a digested by EcoRⅠ and SalⅠ；2-3.pET32a-VP1′ digested by EcoRⅠ and SalⅠ；4-5.pET32a-VP1′ plasmid

图2　质粒 pET32a-VP1′酶切图谱

Fig.2 Restrictive mapping of recombinant plasmid pET32a-VP1′

                                  

M.蛋白质分子质量标准(宽)；1.未诱导的pET32a-VP1′；2～4.经1 mmol/LIPTG、28 ℃诱导的Trx-His -VP1′融合蛋白(3 h～5 h)的表达；5～6.诱导的BL21菌
M.Protein LMW Marker(broard)；1.pET32a-VP1′withnot IPTG induction；2-4.The expression of fused protein Trx-His -VP1′ (3 h-5 h) by 1mmol/LIPTG and  28 ℃ induction；5-6.BL21 with IPTG induction

图3　融合蛋白表达的SDS-PAGE分析

Fig.3 SDS-PAGE of the expression of fused protein

                                

1.未诱导的pET32a-VP1′；2.诱导的空载体pET32a；3，5.诱导的M.蛋白质分子质量标准(宽)；pET32a-VP1′裂解后BL21菌沉淀(包涵体)；4.诱导的pET32a-VP1′BL21菌裂解后上清；6.经尿素溶液初步纯化的融合蛋白
M.Protein LMW Marker(broard)；1.pET32a-VP1′ with not IPTG induction；2.The empty vector pET32a with IPTG induction；3，5.Precipitate of sonicates of BL21 which contain plasmid pET32a-VP1′ with IPTG induced(Inclution body)；4.Supernatant of sonicates of BL21 which containplasmid pET32a-VP1′ with IPTG induction；6.The fused protein purificated by urea

图4　融合蛋白经SDS-PAGE分析是否可溶

Fig.4 Solubility analysis of fused protein by SDS-PAGE

                                 

M.蛋白质分子质量标准(宽)； 1.纯化后Trx-His-VP1′融合蛋白；2.pET32a空质粒Trx-His融合蛋白
M.Protein LMW Marker(broard)；2.Purification of fused protein Trx-His  

图5 pET32a-VP1′-Trx-His融合蛋白经Western- blotting检测

Fig.5 Western-blotting purification of fused protein Trx-His -VP1′ 

3　讨论
鸡贫血病毒基因组中有3个重叠部分的开放读码框，其中，VP1基因为1347 bp，VP2为648 bp，VP3为363 bp。分别编码51.6、24、13.6 ku的3种蛋白。早在1990年，Todd D等[sup][5][/sup]在研究VP1结构时就发现VP1的N端有一个氨基酸拖迹——组蛋白的前体，而组蛋白主要由精氨酸组成，精氨酸能够和DNA链牢固地结合在一起，起保护DNA的功效，故VP1的N端区可以结合在病毒衣壳内的单链环状DNA中，在感染24 h后可以检测到。
本试验针对GenBank中CAV全基因序列设计相关引物PCR得到VP1基因大片段，试验前期也曾利用其他引物PCR得到VP1基因全长，但是将全长重组于pET32a表达载体转化BL21后经诱导无明显蛋白表达，而pET32a-VP1大片段重组子转化BL21菌经诱导有相应蛋白表达，并且经纯化后通过Western-blotting在融合蛋白相应分子质量位置可以检测到与His单抗结合的蛋白。但是其表达量仍然不是很高。为什么二者在表达量上会有差异？而且大片段VP1基因的表达量也不高。影响外源基因在E.coli中表达效率的因素主要包括载体启动子、宿主菌、培养条件、cDNA 密码子的选用、mRNA 的一级和二级结构、表达产物的后加工等。在本研究中所用的Ptac 可控性启动子和带有溶源的T7 RNA 聚合酶基因的BL21宿主菌，能降低外源蛋白对菌体正常生长和分裂的毒害作用。在培养条件方面，28 ℃～37 ℃范围内，在重组菌的生长早、中期，加入不同剂量的诱导剂IPTG (最终浓度为0.1 mmol/ L～1.4 mmol/ L) ，诱导3 h～5 h培养pET32a-VP1′-BL21都无显著差异。
由于只表达了VP1的一个片段，所以本研究中的表达物的体外活性与天然VP1蛋白的生物活性会有一定的差异，不过由于此病毒蛋白体外复制数量太低，体外表达此蛋白对后续免疫动物制备多克隆抗体，进而制备单抗奠定了基础。


参考文献（略）

村夫

这些科技尖端学术，不适应鸡民和兽医，我也看不懂。

归海一刀

太专业了看不懂呀  要是能看懂就好了