禽曲霉菌的诊断

德大动检中心 · 发表于 2010-3-11 19:53:40

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禽曲霉菌病诊断技术（一）

前言
禽曲霉菌病是多种禽类、哺乳动物和人畜共患的一种真菌病。主要侵害呼吸系统，在肺和气囊发生炎症和小结节，导致呼吸困难，甚至窒息死亡。病原体主要为曲霉属中的烟曲霉和黄曲霉，其次为构巢曲霉、黑曲霉和土曲霉等。本病发生于世界各地，对雏鸡的危害最大，可引起幼雏大批死亡，造成重大经济损失。
对曲霉菌病的诊断，近年来提出了一些新技术。但是，各国确定的常用方法，仍是本标准规定的病理学检查和病原学检查。病理学检查(包括在病变组织内发现曲霉菌)可以确定病性，病原学检查不仅可以提高诊断率，而且能够鉴定曲霉菌菌种。
国际上无相应的诊断标准或规范可供参照。本标准的实施，对提高我国禽曲霉菌病的诊断水平，保证养禽业健康发展，将起到重要的作用。
本标准的附录A、附录B为规范性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出。
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:中国人民解放军军需大学。
本标准主要起草人:宣华、向华。
1范围
本标准规定了禽曲霉菌病病理学和病原学检查的技术要求。
本标准适用于禽(鸟)类曲霉菌病的诊断和检疫。
2病理学检查
2.1材料准备
2.1.1器材
小动物解剖器具，灭菌试管(供采集真菌学检查样品用)，普通显微镜等。
2.1.2试剂
体积分数为10%的甲醛溶液，30%甘油缓冲溶液，其配方见附录A。
2.2尸体剖检方法
按照常规的禽类尸体剖检术式，将可疑病禽的各内脏器官取出，逐一检查。重点检查呼吸系统。如发现可疑病变，先取1份置于无菌中试管内或30%甘油缓冲溶液(见第A.1章)中，供病原学检查用，再取1份置入10%甲醛溶液内，供病理组织学检查用。
2.3主要病理变化
禽曲霉菌病的病变主要见于呼吸系统，在肺脏和气囊形成数量不等、粟粒大至绿豆粒大的结节，结节质地较硬，切面呈同心圆轮层状。显微镜检查，见结节周边为淋巴细胞、多核巨细胞和成纤维细胞构成的肉芽组织，中央为干酪样坏死区，内含大量的霉菌菌丝。可在气囊、气管、支气管、肺脏及腹膜表面形成大小不一的霉菌斑，菌斑上有灰绿色粒状物或绒球状物。此外，有时在眼睑内、肝、脾、肾、消化系统乃至神经系统表面也能发现类似的结节或菌斑病变。
3病原学检查
3.1材料准备
3.1.1器材
载玻片，盖玻片，培养皿，铂金耳或针，恒温箱，手术刀，普通显微镜等。
3.1.2试剂
20%氢氧化钾溶液，乳酸酚棉蓝染色液，沙保劳(Sabouraud)氏葡萄糖琼脂培养基或改良察贝克(Czapek)氏琼脂培养基等，其配制方法见附录A。
3.1.3样品采集
对病理学检查可疑的病禽，应无菌操作采取带有病变(如结节、霉菌斑等)的组织各数小块，置于灭菌容器(如中试管)内冷藏，并尽快送检，如果不能立即送检，可暂时保存于30%甘油缓冲液中。
3.2检查方法
3.2.1压滴标本法
取结节置于载玻片上，用手术刀切开，由切面刮取干酪样坏死组织，或由病变组织表面刮取霉菌斑，或用铂金针钩取纯培养物置于载玻片中央，加1～2滴乳酸酚棉蓝染色液或生理盐水，用大头针将组织块或菌团撕扯开，压上盖玻片(注意勿产生气泡)，制成压滴标本。如果组织碎块较硬，可改用1～2滴20%氢氧化钾(KOH)溶液，并在火焰上微微加温后压片。显微镜检查时，先用低倍物镜发现目标，再用高倍物镜详细观察菌体形态。经棉蓝(见第A.2章)染色的菌体呈蓝色。

3.2.2分离培养法

取沙保劳(Sabouraud)氏葡萄糖琼脂培养基(见第A.3章)或改良察贝克氏琼脂(见第A.4章)培养皿若干个(通常每份样品用4个)，做好标记。将铂金耳在火焰上烧灼灭菌，冷却后钩取干酪样坏死组织或霉菌斑，均匀涂抹于培养基表面；或者用铂金针蘸取样品，小块点播刺种于培养基表层。接种完毕，将铂金耳或针在火焰上烧灼灭菌，将接种过的培养皿放在27℃或37℃恒温箱内进行培养。通常于36h后即可见菌落出现。菌落形态见附录B(B.2.1.l ，B.2.2.1，B.2.3.1，B.2.4.l和B.2.5.1)。

4结果判定

在可疑病禽(鸟)的病变组织中，观察到或分离出曲霉菌，即可确诊为禽曲霉菌病。如要确定为何种曲霉菌所感染，则需参照附录B，依据菌落和菌体的形态特征，对所分离的曲霉菌进行菌种鉴定。