新城疫检疫技术规范

少林寺

1 主题内容与适用范围

本标准规定了新城疫群体检疫、个体检疫、实验室检验和检疫后处理的技术规范。
    本标准适用了鸡和其他可感染新城疫的禽类。
    2 引用标准
    GB16548-1996 畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程。
    3 群体检疫
  对养禽场、独立饲养的禽群及外售、外运的禽群施行检疫。
    3.1查清免疫状况

    通过询问兽医人员或检查疫病记录，核查被检禽场（群、室）在过去一年内是否出现过新城疫临诊病例，是否有与新城疫病例接触史，周围2km范围内是否发生过新城疫。

    3.2 查清免疫状况
    通过查验免疫证明或查询其他资料，核查被检禽群是否已按规定注射合格疫苗。如按规定免疫并正处于规定的保护期内，禽只健康状况良好，被认为免疫合格。如免疫不符合规定要求，要以合格疫苗再次接种，隔离饲养观察至群体抗体滴度达25以上，全群健康，认为免疫合格；观察期内发现疑似新城疫病禽，须接3.3条和3.4条要求进一步检查。
    3.3 群体临诊检查
    首先作静态检查，让禽群处于静止状态，观察营养状况，精神状态、呼吸、粪便、鼻及口腔分泌物有否异常。然后观察禽只运动状况，有否跛行、共济失调、痉挛等异常现象。检查中重点注意以下情况 a. 精神沉郁或无任何症状而死亡；

    b. 体温升高、食欲减退、精神萎顿、产蛋减少或停止；
  c. 口腔和鼻腔分泌物增多，嗦囊胀满；
  d. 呼吸困难、喉部发出“咯咯”声（晚间较明显）；

    e. 下痢，粪便成绿色；

  f. 偏头转颈，作转圈运动或共济失调。
    若发现疑似病例，按3.4条要求进一步检查，同时对全群隔离饲养。
   3.4 病理解剖检查
对临诊疑似病例，应全部或抽样解剖，依据下述病变作出初步判断。
    a. 口腔、咽喉部有粘液，咽部粘膜出血
    b. 腺胃乳头肿胀，挤压后有豆腐渣样坏死物流出，乳头有散在的出血点；


    c. 肌胃角质下层有条纹状或点状出血，有时见不规则溃疡，腺胃与肌胃交接处有出血斑、条；
    d. 小肠前段有大面积散在出血点，或肠粘膜有纤维性坏死并形成假膜，假膜下出现红色粗糙溃疡；
    e. 盲肠和直肠皱褶处有出血，盲肠扁桃体（淋巴滤泡）出血坏死；

    f. 气管粘膜充血、出血、气管内有粘液；
    g. 心冠脂肪、心耳外膜及心尖脂肪上有针尖状小出血点。
4 个体检查
  4.1 在无群体检疫条件的场合，须进行个体检疫。个体检疫合格的禽只一般供食用，如继续饲养应隔离三周，经观察无异常后，方准与其他禽只混养。
  4.1.1 查明是否为自疫区。
  4.1.2 查验免疫证明。

    4.1.3 临诊检查和病理解剖检查。

  检查内容参照3.3条和3.4条进行，发现疑似新城疫染疫禽只,立即作无害化处理。
    5 实验室检验
    5.1 下列情况进行实验室检验
   a. 产地定期检疫；

    b. 监测免疫状态；
  c. 疑似病鸡的定性，或临诊及解剖检查初步诊断为新城疫，需进一步确诊；
  d. 检疫中发现重大疫情（如禽流感），须作鉴别诊断；

    e. 行政主管部门、饲养单位、售购或争议双方要求进行实验室诊断。
    5.2 实验室检验方法
    a. 病毒分离鉴定试验，见附录A（补充件）。
    b. 血凝抑制试验，用于免疫监测，见附录B（补充件）。
    6 检疫后的处理
   6.1 经临床检查、解剖检查和实验室诊断等综合判定，确诊为新城疫的禽群或禽只，按GB16548处理

    6.2 经初步诊断为新城疫可疑的禽群（禽只），按下述方法之一处理：
    a. 除将可疑禽只按6.1条处理外，全群隔离饲养，并进行紧急免疫接种，如在接种后观察期内出现可疑禽只，亦按6.1条处理。观察21d后，对临床健康，免疫滴度达到25以上的禽只，经体表消毒后按健康禽只对待。
  b. 经初步诊断为新城疫可疑的禽群（禽只），在全群隔离饲养的同时，对可疑禽只采样作实验室诊断，如确为新城疫者，全群即按6.1条处理。

    6.3 发生过新城疫的禽场在半年之内，其禽只不准出售、外运。
   附录A
  病毒分离鉴定试验;
    （补充件）
A1 仪器设备
    a. 注射器：
   b. 注射针头:5~51/2号;

    c. 血凝试验板：V型、96孔;
d. 微量移液器：50μL;
    e. 恒温箱；
    f. 超净工作台或无菌室。

    A2 试剂

   a. 无菌生理盐水；
b. 青霉素；

c. 链霉素；

    d. 标准阳性血清。

|    A3 样品采集及处理
    A3.1 活禽用气管拭子和泄殖腔拭子（或粪）。
A3.2 死禽以脑为主；也可采心、肝、脾、肾、气囊等组织。
  A3.3 样品用生理盐水研成1:5乳液；拭子浸入2~3mL生理盐水中，反复吸挤压至无水滴出，弃之。溶液中加入青霉素（使终浓度为1000单位/mL）链霉素（使终浓度为1mg/mL）泄殖腔拭子（或粪）样品，青霉素、链霉素量提高5倍。然后调PH7.0~7.4,37℃作用1h，再1000r/min离心10min，取上清0.1mL经尿囊腔接种9~10日龄SPF鸡胚。
  A4 培养物收集及检测
A4.1 培养4~7d的尿囊液经无菌采集后--20℃保存。
A4.2 尿囊液按附录B（补充件）作血凝试验，并与标准阳性血清作血凝抑制试验，确定有无新城疫病毒繁殖。

A4.3 MDT（最小病毒致死量引起鸡胚死亡的平均时间）的测定：将新鲜尿囊液用生理盐水连续10倍稀释，10-6~10-9的每个稀释度接种5个9~10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL,37℃孵化。余下的病毒保存于4℃,8h后以同样方法接种第二批鸡胚，连续7d内观察鸡胚死亡时间并记录，测定出最小致死量，即引起被接种鸡胚死亡的最大稀释倍数。计算MDT。
  A4.4 以MDT确定病毒的致病力强弱。40~70死亡为强毒，140h以上为弱毒。
    附录B
  鸡新城疫微量红细胞凝聚抑制试验
    （补充件）
  B1 仪器设备
    a. 微量血凝板：V型、96孔
    b. 微型振荡器；
   c. 塑料采血管；
  d. 移液器：50μL
    B2 试剂

B2.1 稀释液

    PH7.0~7.2磷酸缓冲盐水

    氯化钠(GB166—77) 170g

\
  磷酸二氢钾(GB1274—77) 13.6g
    氢氧化钠(GB629—77) 3.0g
    蒸馏水 1000mL
高压灭菌，4℃保存，使用时作20倍稀释
    B2.2 浓缩抗原
    B2.3 0.5%红细胞悬液
    采成年鸡血，用20倍量磷酸缓冲盐水洗涤3~4次，每次以2000r/min离心3~4min，最后一次5min，用磷酸缓冲盐水配成0.5%悬液。
B2.4 标准阳性血清
  B3 被检血清.
    每群鸡随机采血20~30份血样，分离血清。
  采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6~8cm长。将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min离心5min，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中。若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0℃保存。

   B4 操作方法
    B4.1 微量血凝试验
B4.1.1 于微量血凝板(B1.1)的每孔中滴加稀释液(B2.1)50μL，共滴四排。
    B4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50μL，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取50μL弃之。最后一列不加抗原作对照。

    B4.1.3 于每孔中加入0.5%红细胞悬液(B2.3)50μL。
    B4.1.4 置微型振荡器(B1.2)上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。
B4.1.5 放室温下(18~20℃)30~40min，根据血凝图象判定结果。
  以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复，以几何均值表示结果。
    B4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度。按式(B1)进行计算：
抗原应稀释倍数=血凝滴度/4 ……………………………………（B1）8I

    B4.2 微量血凝抑制试验
    B4.2.1 先取稀释液(B2.1)50μL，加入微量血凝板(B1.1)的第1孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3~12孔，每孔50μL，第2孔加浓度为8个血凝单位的抗原50μL。
    B4.2.2 吸被检血清(B3)50μL于第1孔（血清对照）中，挤压混匀后吸50μL于第2孔，依次倍比稀释至第12孔，最后弃去50μL。

  B4.2.3 置室温(18~20℃)不作用20min.

  B4.2.4 滴加50μL0.5%红细胞悬液(b2.3)于各孔中，振荡混合后，室温下静置30~40min，判定结果。
  B4.2.5 每次测定应设已知滴度的标准阳性血清(B2.4)对照。

    B5 结果判定
    B5.1 在对照出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度
    B5.2 若有10%以上的鸡出现11(log2)以上的高血凝抑制滴度，说明鸡群已受新城强毒感染。
  B5.3 若监测鸡群的免疫水平，则血凝抑制滴度在4(log2)的鸡群保护率为50%左右；在4(log2)以上的保护率达90%~100%；在以4(log2)下的非免疫鸡群保护率约为9%，免疫过的鸡群约为43%。鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示，如平均水平在4(log2)以上，表示该鸡群为免疫鸡群。
  附加说明：

    本标准由中华人民共和国农业部提出。
    本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。
    本标准由农业部动物检疫所负责起草。
    本标准主要起草人马洪超、杨承谕、郑志刚、仰惠芬、王泽霖。