【分享】胚内免疫《从细节到卓越：孵化绩效的实践指南》： 行业内部分享手册 14

共享精神

胚内免疫
Chris Williams. MS. PhD
Director of Technical Service
Zoetis



蛋内免疫涉及若干关键原则， 这些原则对于理解疫苗与胚胎免疫应答之间的相互作用、以及雏鸡对这项技术的耐受性至关重要。

本文将回顾标准化的蛋内免疫操作规程，这些规程可进一步拓展并作为定性评估指标，应用于实验室研究及商业化生产中的免疫方法。

讨论内容将涵盖以下方面：注射技术所面临的物理挑战、疫苗配制的无菌要求、孵化场的卫生与消毒规范。

此外，还将综述注射时胚胎日龄、孵化率、蛋内分区递送方式与免疫应答之间的相互关系。

目前已建立标准化的蛋内免疫操作流程，其核心前提是：不得损害出雏雏鸡，亦不可破坏构成马立克氏病（Marek’s disease）疫苗的鸡胚成纤维细胞。这些标准流程包括：

1.采用专用注射装置，能精准定位蛋壳表面；

2.使用独立的穿刺针管系统——一支用于穿透蛋壳，另一支用于刺破胚胎膜或接触胚胎，以减少交叉损伤；

3.要求极高的消毒效能，防止注射设备在蛋与蛋之间成为病原传播媒介；

4.对整个递送系统实施严格的日常消毒程序，避免病原在不同批次间传播；

5.在所有注射器和种蛋之间实现疫苗的均匀、轻柔处理，这是确保群体内免疫应答一致性的关键。

强烈建议遵循标准化操作规程，以支持对实验室与商业化蛋内免疫方法进行可靠的定性评估和对比研究。

蛋内免疫接种的关键要素包括疫苗的无菌配制，以及疫苗配制实验室所执行的每日、每周和每月的卫生管理规程。

蛋内免疫的关键控制措施包括：

1.疫苗接种设备在使用前后须进行冷灭菌；

2.马立克氏病疫苗的无菌配制；

3.疫苗剂量分配的质量保证；

4.严格区分蛋内免疫与一日龄喷雾免疫的疫苗配制区域，避免交叉污染。

胚胎在卵内注射时的发育阶段、孵化率、分区（卵内）给药与免疫反应之间存在相互作用。

通常，胚胎从孵化器转入出雏器的时间越早，孵化率越低；同样，蛋内免疫操作若过早进行，也会降低孵化率。

从孵化第17天至出雏期间，胚胎各腔室（包括气室、尿囊、羊膜、卵黄囊及胚胎本体）的结构和体积发生显著变化。

疫苗递送位置将影响免疫效力，若马立克氏病疫苗被误注入气室或尿囊，则几乎无保护效力；而当疫苗准确递送至羊膜腔或胚胎本体时，则可提供优异的免疫保护。

在下文概述中，您将深入了解卵内疫苗接种的成功要点。该接种程序涵盖诸多环节（详见下表1），现重点阐述其中若干关键要素供您参考。

胚内疫苗接种是一种兽医医疗程序，属于疫苗接种过程。

该程序能使家禽在极早期接触疫苗，从而对马立克氏病和鸡痘疫苗以及包含传染性法氏囊病、新城疫和传染性喉气管炎的马立克氏病重组或载体疫苗产生早期免疫应答。

表1：蛋内免疫可实现的多重效益


我们来看看商业养殖领域中胚内接种的一些技术机制。

了解这些之后，我们就能深入探讨相关的科学细节。

从技术层面来看，注射流程不仅能减少雏鸡的应激反应，还能实现规模化接种，同时为每枚种蛋精准提供单独剂量。

该流程允许你在孵化场定制疫苗接种方案，而从商业角度而言，它能节省人力、提高孵化场效率，并带来更优的田间养殖表现。

基于这些优势，我们来详细分析一下胚内接种成功的关键要点。

表2：胚内接种的五大关键要点


表2列出了蛋内免疫接种的五个关键要点。

总体而言，当你考虑蛋内免疫接种时，首先需要考虑的是蛋本身。

虽然这显而易见，但机械注射器和设备的操作过程必须能够正确找到蛋壳表面，才能进行注射。

第二个关键要点详细说明了我们如何穿透蛋壳，而又不破坏整个蛋壳的整体完整性。

在此基础上，我们必须考虑卫生消毒问题。这包括注射器本身以及支持疫苗施用的许多周边环境。

注射还必须以正确的角度穿透蛋壳。

进入蛋内的穿刺角度对于将疫苗准确放置在孵化蛋内部的正确位置至关重要。

我们必须了解孵化蛋发育腔室内的目标注射部位。

最后一个关键要点涉及疫苗本身的许多具体细节，例如疫苗如何被泵送并注入蛋内。

蛋位识别

家禽种蛋的孵化是在大型商业化设施中进行的。种蛋被放置在孵化盘或托盘中，再送入大型孵化器内。

由于这些种蛋并非全部完全对齐，注射装置必须能够适应每枚蛋的具体位置--无论是完全垂直竖直放置，还是如图中所示略有倾斜。


图1：注射器对蛋位的识别，显示其具备方向倾斜补偿功能

该装置的位置必须能够针对每枚蛋进行调整，以确保针头进入并将疫苗准确放置在正确位置。当我们考虑蛋位识别时，会看到若干相互关联的细节。


图2：注射器对蛋位的识别，显示其具备蛋高补偿功能

在图2中，我们可以看到不同高度的蛋。因此，无论是在水平方向还是垂直方向上，都必须具备相应的调节能力，以准确定位蛋并以正确的方式进行穿刺。

蛋壳是一个坚固的屏障，它确实含有细菌成分，可能成为病原传播的载体和来源。

如图3所示，采用双针头方法可以穿透蛋壳。

此方法包含多项关键特性，使其成为注射鸡蛋的最优方式。

我们希望递送疫苗的针头与穿透蛋壳的针头分开，以最小化细菌携带或潜在污染的风险。

外针和内针具有不同的斜面设计：一个专门用于刺穿蛋壳，另一个则专门用于递送疫苗（见图4）。


图3：展示‘针中针’刺穿蛋壳和绒毛尿囊膜的鸡蛋注射过程

较大的针头用于刺穿蛋壳，它有四个小孔（上箭头所示），这些小孔允许液体清洁和消毒针头内部和外部，以及内注射针头的外部。这种内外针头的消毒有助于减少乃至几乎消除任何蛋与蛋之间的污染。


图4：‘针中针’的图形描述

在另一幅图示（图4）中，可以看到‘针中针’的设计。

我们使用16号针头以30度斜角穿透蛋壳，并使用20号针头以45度斜角递送疫苗。

这种设计使得疫苗递送非常精确。

鉴于污染的可能性至关重要，蛋内免疫接种立即成功的关键在于有效的针头消毒。

双针系统还允许对注射系统所有接触蛋和胚胎的部位进行非常有针对性的消毒路径。

每次注射之间的针头和穿刺器都会进行消毒处理。

辅助消毒措施包括在每日操作前后使用的疫苗通路清洁系统，确保整个疫苗输送系统的卫生。

定期对疫苗输送系统进行灭菌是必不可少的，以防止灾难性的污染事件发生。

当我们观察注射周期时，首先看到的是注射装置定位到蛋上以开始注射过程。

疫苗的递送时间和位置与消毒液的递送是分开的。

消毒周期在注射器完成注射并停留在蛋上方时启动。

当定位器在接种后从蛋上移开并回到其最高静止位置时，消毒周期开始。

消毒周期实际上包含两次独立的液体释放：

1.第一个消毒液团通过泵作用立即排出，用于即时的初步清洁。

2.在整个周期即将结束时，会释放第二个消毒液团，同时伴随一股空气喷射，这有助于彻底清洁蛋定位器杯和注射器内部的所有区域。

所使用的消毒液是一种基于氯的消毒剂，具有缓冲pH值（中性），因此其作用机制是通过酸性膜破坏（次氯酸）实现非常快速的接触杀灭效果。

我们在消毒方面还有其他关注点，包括疫苗配制实验室区域的环境。

蛋内疫苗的配制区域必须与一日龄喷雾疫苗的配制区域分开。

疫苗配制必须是无菌的；疫苗本身必须是无菌的。

疫苗细菌污染最常见的环节之一是在冷冻安瓿的解冻过程中。

马立克氏病疫苗是冷冻保存的，在解冻过程中会使用解冻水浴。

如果安瓿在开启前未彻底擦干，解冻水浴就可能成为污染源。

在疫苗混合的实验室中，有许多情形是完全不可接受的。

混合操作台面和解冻水浴应按照正确用途进行设计。

必须执行每日、每周和每月的消毒程序。我们需要一个专门用于蛋内疫苗配制的清洁区域。

我们需要经过培训的人员来进行疫苗混合。

无菌的疫苗混合及在整个注射过程中的处理应当是他们唯一的工作职责。

蛋内接种所用疫苗一旦发生细菌污染，可能导致灾难性后果。

蛋内递送装置可能将细菌传递到每一枚种蛋。

我们必须确保疫苗的清洁和无菌。

另一个次要的消毒关注点是出雏筐。

鸡蛋注射后会被放入出雏筐中。

出雏筐是蛋内免疫过程中卫生控制的重点区域。

出雏筐在用于蛋内免疫流程前必须清洁并干燥，因此这是生产周期中一个非常关键的质量控制点。

注射位点

第三个关键要点是实际的注射位点，即疫苗在孵化蛋内的递送位置。

这是一个真正具有科学意义的关键控制点，也是该技术的基础。

我们从研究中得知，蛋内某些区域对马立克氏病疫苗和禽痘疫苗的效果至关重要。

因此，正如我们之前讨论的蛋位识别、蛋壳穿透和消毒的重要性一样，这些机械性要点最终都汇聚于注射位点。

我们必须将疫苗递送到羊膜或胚胎本体。

但这一要求在生理学和发育学上的依据是什么？其物理基础又是什么？


图5：孵化第18天鸡胚胎内五个腔室的示意图

在发育后期进行注射时，蛋内存在五个腔室。

如图5所示，我们有气室和尿囊，它们是胚胎的重要支持结构。

尿囊是胚胎发育过程中处理废物和储存水分的部位。

我们还可以看到胚胎本身以及包裹胚胎和卵黄囊的羊膜。

关于孵化后期雏鸡胚胎发育，2002年的一项研究阐明了当疫苗被注入不同发育腔室时，马立克氏病疫苗效力的差异。

注入气室的马立克氏病疫苗不会引发任何免疫反应。

当疫苗注入尿囊液中时，效力欠佳，无法产生良好的疫苗应答。

而将马立克氏病疫苗注入羊膜或胚胎本体，则可产生非常好的疫苗应答，这一点通过在免疫后第8天（即5日龄）使用强毒力马立克氏病病毒（RB1B株）进行攻毒试验得到验证。

关于有效疫苗接种的孵化“窗口”时间，从商业日历角度来看，我们可以针对从孵化器转移到出雏区的时间进行目标设定，通常是在孵化大约17.5天到19天之间。

但更为重要的是，我们需要确保胚胎发育已达到可以准备出雏的阶段。

当胚胎的头部位于右翼下方（见图5），并且卵黄柄开始进入腹腔时，胚胎就处于准备出雏的位置。这是生理上最早可以进行疫苗接种的时间点。

在注射时，理论上最晚的发育状态应该是蛋壳外部开始出现啄壳。

我们的目标是0%的蛋出现啄壳现象，以避免使转移过程复杂化（即将种蛋从孵化盘移至出雏筐）。

然而，在商业孵化场处理大量种蛋的情况下，少量啄壳是可以接受的。

由于时间安排的要求，在某些孵化情况下，注射时可能会遇到一些胚胎发育稍有提前的情况。


图6：按孵化日龄划分的疫苗注射位点百分比示意图（研究报告01-00-1101，Zoetis公司）

当我们观察疫苗递送位置如何随孵化日龄变化时，可以看到在孵化第18天，大部分疫苗被注入羊膜内。

随着胚胎发育至孵化第19天，越来越多的疫苗被直接递送至胚胎本体（见图6）。

这一点是合理的，因为随着胚胎逐渐长大，其发育支持腔室（尿囊、羊膜、卵黄囊）会相应缩小。


图7：按母鸡周龄（青年、盛产期、老龄）和孵化器类型（Jamesway、ChickMaster）划分的胚胎发育阶段（发育评分）分布图（研究报告4Z10W-00-09-282，Zoetis公司）。

当我们观察美国两种主要的孵化类型时，有巷道式ChickMaster和Jamesway。

大多数箱体孵化在基于发育时间的群体曲线形态上也与之基本一致（无论是用Jamesway、ChickMaster 还是箱体孵化器，只要在对应的发育时间点观察，种蛋群体的胚胎发育进度分布趋势（曲线形状）是相近的。）。

Jamesway巷道孵化器通常在胚胎发育第18天进行转盘/注射，而大多数多阶段ChickMaster系统则在孵化第19天进行转盘/注射。

我们还发现不同鸡群周龄会影响胚胎发育（图7）。

这一现象主要与产热能力和早期胚胎发育有关。

来自盛产期鸡群的种蛋在孵化后期的发育略快于青年和老龄母鸡所产的种蛋。

当我们观察第18天或第19天（图6）时，这些图表代表了正常的种蛋群体发育曲线。

该曲线基于注射和转盘时胚胎的发育阶段评分。


图8：疫苗递送至羊膜

那么，疫苗递送是什么样子的呢？

这里我们看到一枚在孵化第18天注射的蛋（图8），可以看到蓝色染料标记的疫苗被递送到了羊膜内。

蓝色来自染料本身。

如果你使用一种能与蛋白质结合并染色的染料，就能看到雏鸡羽毛被染成蓝色。

这是一种良好的蛋内疫苗递送位置。


图9：疫苗皮下或肌肉内（IM）递送

当我们观察一枚发育稍更成熟的胚胎时，可以看到疫苗被递送至皮下组织（图9，左图）；若进一步仔细观察，可见部分疫苗已进入右侧胸肌（右图）。

这两种均为良好的疫苗接种位置。

如果我们采用一种评估方法来观察疫苗的递送位置，发现疫苗位于气室或尿囊的排泄腔内，则可知这些并非我们期望的递送部位，且不具备有效性。

疫苗规范

在考虑上述所有关键要点之后，我们来到最后一个关键点——疫苗规范。

马立克氏病疫苗是一种细胞结合型病毒疫苗，因此我们必须非常轻柔地处理该疫苗。

我们需要保持鸡胚成纤维细胞的活性，因为马立克氏病疫苗病毒存在于这些成纤维细胞内部。

对不同类型的泵送和递送系统进行测试后发现，蛋内疫苗递送必须轻柔。

候选递送系统的设计模仿了肾透析泵或心脏替代泵，因其具备轻柔处理活细胞的能力。


图10：疫苗递送泵送系统（左图为示意图，右图为实物照片）

如上图所示（图10），这些小型隔膜泵的设计仿照心脏置换泵，能够将疫苗从储液袋中安全地通过针头输送至胚胎。

当我们更详细地观察时，马立克氏病感染的成纤维细胞直径约为10至12微米，而针头尖端开口的直径约为580微米。

因此，在针头内部横截面上，我们可以想象并容纳超过50到60个这样的细胞。

由此可见，马立克氏病疫苗并非高浓度递送，其细胞浓度不到0.5%（细胞在疫苗悬液中所占体积极小）。

因此，操作处理极为重要。


图11：美国批准用于蛋内免疫的疫苗类型

显然，只有经批准可用于蛋内免疫的疫苗才是安全的（见图11）。

目前已有超过30种不同的疫苗用于蛋内接种。

各类疫苗及其组合的关键在于安全性和有效性。

疫苗必须对胚胎安全。

当我们考虑胚胎的发育阶段及其免疫系统时，马立克氏病疫苗是整个蛋内免疫体系的基石。

因此，传统马立克疫苗和HVT重组疫苗是非常有效的递送方式，能够提供极早期且高效的免疫应答。

马立克氏病疫苗有不同血清型。我们知道，血清型3（即HVT）被用作马立克载体或重组疫苗的骨架。

但需要注意的是，不能将HVT与HVT重组疫苗混合使用，因为HVT的复制速度比重组病毒更快，会显著降低载体疫苗的效力。

免疫的起效时间和持续时间与疫苗递送时机密切相关。

我们希望雏鸡在入舍时已具备良好的免疫应答。

因此，疫苗的安全性很大程度上取决于注射时的胚胎发育阶段以及疫苗本身的生物安全性。

母源抗体也是一个重要考量因素——在注射时，母源抗体尚未完全从卵黄囊吸收并进入胚胎体内。

这意味着，蛋内免疫是在母鸡提供给胚胎和雏鸡的天然保护（通过母源抗体）尚未完全建立之前进行的。

因此，在选择用于蛋内接种的疫苗时，安全性至关重要。

总之，当我们考虑蛋内免疫接种的五个关键要点时，还必须考虑它们之间的相互作用。

在关注种蛋本身时，我们必须确保注射器能够准确定位种蛋，并具备穿透蛋壳而不造成损伤或污染的能力。

我们必须在胚胎发育的适当时间点进行操作，并将疫苗递送至正确的胚胎腔室。

我们还需关注消毒问题，这不仅涉及注射过程本身，还包括孵化场环境以及疫苗配制实验室中的外部环节。

此外，疫苗的处理方式和疫苗类型也有非常具体的要求，以确保蛋内免疫流程达到最佳效果。

综合考虑所有这些关键要点，我们必须认识到这些因素是相互关联的。

正是对这五个关键要点及其相互作用的细节关注，才构成了一个成功的蛋内免疫接种项目。

来源：poultry times，作者：Eduardo Costa

牧鱼郎

这个技术，应该应用的还不多吧