【分享】2022-2023年我国鸡传染性法氏囊病的流行情况分析

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■  摘要：为全面了解我国近两年市场中鸡传染性法氏囊的变化情况，通过对法氏囊病毒样本进行特异性VP2基因扩增测序，以此来确定当前法氏囊病毒的流行情况。本研究应用RT-PCR方法对来自河南等省份的35份临床疑似病料样本进行检测，确定有19份样本为阳性。用测序引物对基因的高变区进行测序，获得相应的核酸序列，将所获得序列与参考毒株进行比较，绘制成遗传进化树。研究结果表明，我国现阶段鸡传染性法氏囊病毒流行情况主要为强毒株和变异毒株。

■ 关键词：鸡传染性法氏囊病；流行情况；分析

■ 传染性法氏囊病在美国特拉华州甘保罗镇首先爆发，最初被称为甘保罗病，是由传染性法氏囊病毒引起的一种急性、高度接触性的传染性疾病，是目前影响养禽业发展最重要的疾病之一。主要侵害雏鸡法氏囊等免疫器官中未成熟的B淋巴细胞或B淋巴细胞前体细胞，可造成鸡的免疫抑制，增强鸡对其它微生物的易感性，从而使其他病毒性或细菌性疾病并发或继发感染。同时也会导致疫苗免疫接种失败，给养殖户造成巨大经济损失。该病毒是一种无囊膜双链RNA病毒，直径约60nm，属于双RAN病毒科禽双RNA病毒属。VP2是该病毒外表面的主要结构蛋白，也是病毒的主要宿主保护性抗原，可诱导其产生保护型中和抗体，并具有血清型特异性，与毒力变异、细胞凋亡有关，因此该基因被认为是研究病毒毒力和变异的主要基因。为了更好的了解并掌握现阶段IBDV流行情况，实验室收集来自河南等省份疑似鸡传染性法氏囊发病样本进行检测。

1、材料

试验所用病料为2022-2023年采自市场疑似发病鸡的法氏囊、脾脏等脏器，SPF鸡胚购自济南赛斯家禽科技有限公司，提取试剂盒、反转录试剂盒及PCR试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司，高保真酶购自MCLAB，胶回收试剂盒、载体连接试剂盒、DH5α感受态细胞、引物由擎科生物提供。

2.方法

2.1病料处理

将市场采集疑似鸡传染性法氏囊的法氏囊和脾脏放于平皿内，用无菌PBS（含4000IU双抗）进行清洗，清洗后转移至干净无菌的平皿内剪取小块组织并剪碎，将剪碎的组织样本移至研磨管内，按照1:5的比例加入无菌PBS(含4000IU双抗)，进行研磨处理，将处理后样本进行12000rpm离心10min，吸取上清备用。

2.2病毒液接胚扩繁

取处理好的组织上清液接种于10日龄SPF鸡胚的绒毛尿囊膜，每胚接种0.3微升，接种后24h照检一次，之后每12h照检一次直至96h，期间随时取出死胚4℃保存待收。培养结束后，收取所有鸡胚的绒毛尿囊膜及组织，并进行捣碎研磨，吸取研磨上清待检。

2.3核酸检测

第一，核酸提取。取处理好的组织上清液200ul存于EP管，按照1:10的比例配制蛋白酶，每个样本配制220ul，将配好的蛋白酶加入样品管后震荡混匀，将混好的样本放入56℃水浴锅处理15min，时间结束取出样品管加入250ul无水乙醇，震荡混匀后静止5min，将处理好样品液全部倒入离心柱内，进行12000rpm离心1min，弃掉滤出液后继续用洗液清洗两遍离心柱，最后进行12000rpm空离离心柱，弃掉滤出液后更换EP管，用无酶水洗脱离心柱核酸,从而获得样本总核酸样。

第二，反转录扩增。将提取后核酸加入到配制的反转录酶内进行反转录，最后将CDNA加入扩增体系内完成PCR扩增，扩增体系为25ul，5*浓缩buffer12.5ul、水9.5ul、上下游引物各0.5ul、反转录样品2ul。PCR反应条件为95℃3min，95℃30s，55℃32s，72℃1min，34个循环，72℃延伸7min，4℃无限循环。

第三、电泳转化。将PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定， 用胶回收试剂盒目的片段进行回收，与载体连接并转化DH5α感受态细胞，进行培养后取阳性克隆进行测序，测序由金唯智生物技术有限公司完成，最后将所得序列进行比对分析。

3.结果

试验毒株经核酸电泳可见有19株目的条带，为法氏囊阳性，见图1。


图1（2000Marker、+阳性、-阴性、1-19为阳性样）

应用VP2测序引物扩增以上19个阳性毒株，将扩增片段连接载体并转染至感受态细胞培养后，经电泳确定，获得与目的大小一致的序列片段，见图2。


图2.（2000Marker、+阳性、-阴性、1-19样品）

所测序序列与NCBI下载法氏囊核酸序列进行比较，绘制如下进化树：


图3.进化树（红色△为标准株、蓝色○代表本次研究毒株）

■  结语：本研究通过对河南等省份疑似法氏囊发病病料进行研磨处理，接胚检测，成功扩增出19株法氏囊阳性毒株。针对这些法氏囊阳性的VP2基因进行扩增比对，发现市场流行的法氏囊病毒为鸡传染性法氏囊强毒和变异株两大类，其中变异株比例高于强毒株，且变异株主要感染商品肉鸡，强毒株主要感染青年阶段蛋鸡，说明近两年法氏囊病毒在养禽场持续存在，研究人员仍需加强对该病变异情况的研究，为养殖业提供更切实可行的防控方案，以推动养殖业健康发展。

参考文献：
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来源：乾元浩之友，检测员：张丹丹