【分享】QX型与Mass型传支病毒对产蛋期母鸡输卵管不同节段致病性

共享精神

背景

禽传染性支气管炎（IB）是一种由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的高度传染性急性病毒性呼吸道疾病，主要感染鸡群。

作为一种呼吸道疾病病毒，IBV最初靶向支气管上皮细胞，并引发急性呼吸道症状，如气管啰音和呼吸困难。此外，部分毒株还可扩散至泌尿生殖系统，引发严重肾炎，导致蛋鸡产蛋量和蛋品质下降。同时，受感染的鸡群还易继发支原体、细菌或其他病原体感染，造成死亡率上升。

在中国，QX型传染性支气管炎病毒于1997年首次报道从山东省青岛市一群患有腺胃炎的内仔鸡中分离出来。过去二十年间，全球多个国家和地区也相继暴发疫情，并逐渐发展成为许多地区的流行基因型。

QX型传染性支气管炎病毒对多器官具有高致病性，可导致严重的气管纤毛损伤、肾脏明显苍白肿大、输卵管和卵泡发育异常。感染鸡只常表现为输卵管特征性扩张及浆液样积液，即所谓的囊肿性输卵管。

产蛋期感染鸡群虽卵巢发育正常，但因输卵管变性闭锁导致卵黄坠入腹腔，引发腹膜炎，此过程中形成“假母鸡”综合征。生殖系统疾病的严重程度因病毒毒株、感染时期及宿主个体差异而有显著不同。属于QX型的不同毒株在致病力上也表现出显著差异。

尽管已知QX型传染性支气管炎病毒会对雏鸡输卵管造成严重损伤，进而影响产蛋，但当感染发生在产蛋期时，其对输卵管的致病机制仍不甚明确。

此外，输卵管在形态学上分为四个不同功能节段，包括漏斗部、膨大部、峡部和子宫部。蛋白、蛋壳膜和蛋壳分别形成于膨大部、峡部和子宫部。蛋壳膜呈现纤维网状结构，主要由胶原蛋白和糖蛋白组成。蛋壳膜中存在I型和V型胶原蛋白，其比例约为100:1。在禽类蛋壳腺中，钙结合蛋白（钙结合素，CaBP）以28 kDa的高分子量蛋白质形式存在（CaBP-D28k），并在钙运输中发挥作用2+以促进蛋壳形成。因此，有必要研究QX型传染性支气管炎病毒对输卵管不同节段的影响。

本研究旨在更好地理解传染性支气管炎病毒的致病机制。为此，我们采用QX型毒株QXL和马萨诸塞型毒株M41（主要引发呼吸道症状）进行实验，比较二者对输卵管不同区段的致病性差异。通过检测抗原分布、组织病变、促炎细胞因子表达、细胞毒性分子、I型干扰素及蛋壳形成相关基因的表达水平来评估病理变化。

材料与方法（略）

结果

组织病理学和免疫组织化学A2、B2、C2、D2），M41株抗原主要分布于黏膜上皮纤毛层（图1A3、B3、C3、D3）。QXL株抗原在峡部的分布范围较输卵管其他节段更为广泛（图1C2)。在膨大部、峡部和子宫中，QX型毒株组的积分光密度值显著高于M41组（图。1E）。1E)



感染后第4天QX和Mass型IBV抗原的免疫组化检测。A1–D1对照组输卵管不同节段。A2–D2QXL组输卵管不同节段。A3–D3M41组输卵管不同节段。输卵管各节段免疫组化评分总和。*<?0.001表示QXL组与M41组存在显著差异。黑色箭头指示抗原沉积。比例尺：50或100微米。E，黏膜上皮；L，管腔；LP，固有层。P?<?0.05, **P?<?0.01, ***P?<?0.001 ，

在QXL组和M41组之间存在显著差异。黑色箭头表示抗原沉积。比例尺：50 μm或100 μm。E，粘膜上皮；L,腔;LP，固有层。

采用H.E染色法评估输卵管各段的病理变化。对照组中，漏斗部、膨大部、峡部及子宫部的黏膜上皮均衬有纤毛假复层上皮，固有层内布满管状腺体(图。2A1、B1、C1、D1)。在QXL组中，可见大量淋巴细胞浸润至固有层结缔组织内(图。2A2、C2），而M41组中很少观察到炎性细胞。在QXL组的漏斗部和膨大部观察到管状腺体的明显扩张（图。2A2、B2），而在M41组的峡部和子宫观察到上皮细胞剥脱（图。2C3、D2）。此外，由于QXL组子宫固有层的间质扩张，管状腺体密度降低（图。2D2）。

图2



输卵管内QX型和马萨型传染性支气管炎病毒感染后第四天的致病性组织病理学分析。A1–D1对照组输卵管不同节段。A2QX型感染组输卵管漏斗部，黑色箭头显示固有层结缔组织中分布的巨噬细胞和淋巴细胞，白色箭头显示管状腺体的增生扩张。B2QXL组的膨大部，白色箭头指示管状腺体的扩展包。C2QXL组的峡部，黑色箭头指示固有层间质中淋巴细胞浸润。D2QXL组的子宫部，白色箭头指示间质扩张。C3M41组峡部，白色箭头指示上皮细胞脱落。D3分段M41组子宫部位，白色箭头指示上皮细胞脱落。比例尺：50微米。E，粘膜上皮；L，管腔；LP，固有层。

促炎性细胞因子基因和细胞毒性免疫反应相关基因表达的变化为评估输卵管各分段炎症程度，在感染后第4天和第8天检测了促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、IFN-γ和IL-2）的表达水平。结果显示：QXL组峡部在第4天、子宫在感染后第4天和第8天的IL-6表达均显著高于对照组；而在感染后第4天，QXL组与M41组在漏斗部与膨大部的IL-6表达均显著低于对照组（图。3A). 在膨大部，QXL组IL-1β的表达量在4天和8天时显著高于对照组；在峡部和子宫部，该表达量在4天时显著更高（图。3B). 在漏斗部和峡部，QXL组IFN-γ的表达量在4天和8天时显著高于对照组；在子宫部，该表达量在8天时也显著更高（图。3C). 在漏斗部和子宫部，QXL组IL-2的表达量在8天时显著高于对照组；在膨大部和峡部，该表达量在4天和8天时均显著更高（图。3D)。



QX型与Mass型传染性支气管炎病毒对输卵管不同区段促炎细胞因子基因mRNA表达的影响IL-6、IL-1β、IFN-γ及IL-2的表达变化倍数均值±标准误（n=3）。*<0.0001表示感染组与对照组存在显著差异。DPI：感染后天数；SEM：均值标准误，IFN-γ 和 D IL-2。数值以感染组与对照组相比表达量变化的平均值±标准误（n = 3）表示。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001 分别表示感染组与对照组之间存在显著差异。DPI，感染后天数；SEM，均值的标准误。

感染后第4天和第8天检测到细胞毒性分子（颗粒酶和穿孔素）及IFN-α。QXL组在感染后第8天漏斗部及第4天膨大部的IFN-α表达量均显著高于对照组（图4A）。QXL组颗粒酶表达量在感染后第8天漏斗部、第4天膨大部以及第4天和第8天子宫部均显著高于对照组（图4B). 在蛋鸡输卵管膨大部，QXL组穿孔素表达量在4天和8天时均显著高于对照组；在子宫部，QXL组穿孔素表达量在8天时显著高于对照组（图。4C). 此外，在输卵管峡部，QXL组和M41组的颗粒酶和穿孔素表达量在4天和8天时均显著低于对照组（图。4B, C)。

图4



QX型和Mass型传染性支气管炎病毒在输卵管不同区段对IFN-α（A）、颗粒酶（B）和穿孔素（C）mRNA表达的影响。数值表示为表达量倍性变化的均值?±?标准误（n?=?3）。*<?0.001表示感染组与对照组之间存在显著差异。DPI，感染后天数；SEM，均值标准误。C)。数值以感染组与对照组相比的表达量变化倍数的平均值 ± 标准误（n = 3）表示。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001 分别表示感染组与对照组之间存在显著差异。DPI，感染后天数；SEM，均值的标准误。

蛋壳形成相关基因表达的变化

为了评估蛋壳形成相关基因的表达情况，我们分别在输卵管峡部和子宫部位检测了I型胶原蛋白和钙结合蛋白D28K的表达水平。在峡部，QXL感染组在感染后第8天的I型胶原蛋白表达量显著低于对照组（图5A）。而在子宫部位，QXL感染组在第4天和第8天的钙结合蛋白D28K表达量均显著低于对照组（图5B）。

图5



QX型和Mass型传染性支气管炎病毒在输卵管峡部与子宫部位对I型胶原()及钙结合蛋白-D28K(）mRNA表达的影响。数值表示为表达量倍性变化的均值?±?标准误（n?=?3）。*)mRNA表达的影响 %% <0.01表示感染组与对照组之间存在显著差异。DPI，感染后天数；SEM，均值标准误).。

讨论

目前，QX型是亚洲、欧洲及世界其他地区家禽群中传染性支气管炎病毒的主要基因型，给家禽业造成了巨大的经济损失。已有数份报告阐述了不同QX型分离株在幼鸡特定器官中的致病性。然而，病毒在产蛋期感染后对输卵管的损伤变化仍属未知。

本研究开创性地分析了QX型传染性支气管炎病毒对蛋鸡输卵管不同分段的病理影响，并将其与Mass型参考毒株M41进行了比较。

病毒与宿主细胞结合是病毒复制周期中的第一个关键步骤。之前的研究证实，QX毒株能够在体外感染小母鸡输卵管的上皮细胞。本研究中我们发现QX型和M41型毒株均能感染产蛋鸡输卵管的上皮细胞；然而QX型毒株还会大规模感染管状腺体。这一结果表明QX型毒株可能通过某种未知机制（该机制由QX型而非M41型毒株介导）轻易从黏膜上皮层释放至固有层。

先前报道表明，QX型传染性支气管炎病毒会导致雏鸡输卵管特征性扩张和浆液样液体蓄积，但该器官的微观病理改变较为轻微。在本研究中，QXL毒株对蛋鸡输卵管各段造成严重损伤，包括漏斗部和膨大部管状腺体扩张、漏斗部和峡部炎性细胞浸润、以及子宫部黏膜固有层间隙扩张。这种差异可能由鸡只日龄或实验条件不同所致。而在M41感染组中，仅观察到峡部与子宫部位的上皮细胞脱落现象。这一结果与既往研究一致：Mass型传染性支气管炎病毒可引起输卵管器官培养物中的上皮细胞变性及脱落。

通常，宿主通过经典的炎症反应和由干扰素介导的抗病毒免疫反应来抵御细胞内病毒。干扰素-γ是Th1细胞主导反应中的关键细胞因子，对于控制细胞内病原体至关重要。在炎症反应中，干扰素-γ还能与促炎细胞因子（如IL-1β和IL-6）协同作用。已有研究表明，减毒传染性支气管炎病毒的感染会上调包括IL-1β、IL-6和干扰素-γ在内的促炎细胞因子表达[21目前结果显示，在QXL组中，IL-1β、IL-2和IL-6的表达量较正常值升高约2-30倍，而IFN-γ的增幅更为显著，某些情况下超过正常值的500倍。本研究在QXL组输卵管的漏斗部观察到巨噬细胞聚集，该部位IFN-γ表达量提升了近500倍。I型干扰素是机体对病原体先天免疫反应的标志性因子，可直接或间接作用于自然杀伤（NK）细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)、树突状细胞(DCs)和B细胞参与调节适应性免疫反应的作用机制[32]。目前的结果表明，在QXL组中，漏斗部和膨大部的IFN-α表达量有所升高。此外，我们还观察到，除峡部外，QXL组输卵管中颗粒酶和穿孔素的水平显著增加。这些数据表明，QXL毒株可诱发由Th1细胞主导的细胞介导炎症反应，进而招募巨噬细胞、NK细胞及其他先天免疫细胞分泌I型干扰素和细胞毒性分子以抑制病毒。但过度的免疫反应也可能导致输卵管病变。然而在QXL组的峡部，既未检测到IFN-α也未发现细胞毒性分子，且免疫组化结果显示病毒抗原在峡部分布最为广泛。这些结果表明，与其他输卵管节段相比，峡部对QXL毒株更为易感。而在M41毒株感染组，促炎细胞因子和抗病毒分子的表达未见显著改变。由此我们推测，诱导先天免疫应答的能力可能与病毒的致病性有关。这一发现与既往研究。

禽支气管炎病毒的感染会影响鸡蛋品质，例如导致软壳蛋和沙壳蛋的产生。因此，我们评估了与蛋壳及蛋壳膜形成相关基因的表达情况。I型胶原蛋白在输卵管峡部表达，蛋壳膜在鸡蛋通过输卵管过程中形成。已有研究表明，纤维成分由峡部的管状腺体分泌[35目前结果表明，攻毒后第8天，QX型感染组峡部I型胶原表达下调。正常情况下，子宫内钙结合蛋白D28k的mRNA水平在蛋壳钙化过程中会升高[36钙沉积不足是蛋壳形成过程中导致蛋壳质量差的关键原因。

我们的研究结果表明，在病毒攻击后第4天和第8天，QXL组CaBP-D28k的表达量均显著低于对照组。峡部和子宫中I型胶原及CaBP-D28K合成量的下降可能与免疫相关分子水平升高有关。因此，QXL毒株可能通过抑制I型胶原和CaBP-D28k的合成来影响蛋壳膜和蛋壳的形成。这一结果也支持了Nii等人[21在无性向的研究中，减毒传染性支气管炎病毒可降低Ⅰ型胶原蛋白和CaBP-D28k的表达水平。

结论

本研究结果可能有助于增进对产蛋期鸡群QX型传染性支气管炎病毒致病性的认知，并制定干预该感染的策略。但本研究主要属于现象描述，QX型病毒对输卵管的致病机制仍需进一步探究。总体而言，我们的研究结果凸显了QX型传染性支气管炎病毒对产蛋期鸡群输卵管各段的高致病性，其主要表现为粘膜基层的显著病理改变以及与蛋壳和壳膜形成相关基因的表达紊乱。

来源：鸡保姆，致谢本文原作者：张小荣, 闫锟（yankun）, 张程程, 郭梦娇, 陈淑琴, 廖凯, 柏宗艺（ BoZongyi）, 曹永忠和吴艳涛老师。

黄炎坤