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【分享】兽医诊断会议笔记(一)张建强:美国禽偏肺病毒A/B亚型新发暴发——PCR检测

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鸡病专业网编辑

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发表于 4 小时前 | 显示全部楼层 |阅读模式 来自: 中国河南

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会议笔记(一)

报告人:张建强,爱荷华州立大学教授

报告主题:美国禽偏肺病毒A/B亚型新发暴发——PCR检测频率、病毒分离挑战与应对策略


2023年末至2024年初,一度在美国沉寂多年的禽偏肺病毒(Avian Metapneumovirus, aMPV)以A亚型和B亚型的形式卷土重来,并迅速蔓延,给美国养禽业带来了巨大冲击。在本次国际兽医诊断大会上,来自美国爱荷华州立大学(Iowa State University)的张建强教授,基于其诊断实验室的一手数据,系统分享了此次aMPV在美国的PCR检测流行情况、病毒分离过程中的挑战与突破,以及对未来防控的启示。

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张建强,爱荷华州立大学兽医诊断实验室的教授和病毒学家。他目前是Lora and Russ Talbot兽医学讲席教授。他主要从事兽医病毒的诊断,发病机制和疫苗开发。他有~180篇同行评审的文章及书籍章节。他是《猪病学》(英文第11版和第12版)的编辑之一以及JVDI期刊病毒学编辑。

一、 疾病背景:一个病毒,多个“面孔”

讲者首先对禽偏肺病毒感染进行了概述。aMPV感染在历史上曾有多个名称,如火鸡鼻气管炎(TRT)、禽类鼻气管炎(ART)、禽肺病毒(APV),以及更为人熟知的肿头综合征(SHS)。其临床表现主要集中在呼吸道,引发鼻窦炎等症状,并可导致头部肿胀、死亡率增加和产蛋量显著下降,对家禽养殖业造成严重经济损失。

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二、病毒学特性与分类

从病毒学角度看,aMPV属于肺病毒科(Pneumoviridae)、偏肺病毒属(Metapneumovirus)。它是一种多形性的、拥有负链单股非节段RNA基因组的病毒。在其多种编码蛋白中,糖蛋白(G protein)是介导病毒与宿主细胞受体相互作用的关键蛋白,其基因序列的高度可变性,是目前进行aMPV亚型分类和鉴定的核心依据。

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aMPV的传播途径多样。演讲者指出,其水平传播途径明确,可通过受感染禽群直接接触或经由被污染的饲料、饮水、人员和设备等环境媒介进行传播。此外,野鸟也被认为是潜在的传播媒介。然而,关于其是否能够垂直传播,目前行业内尚无定论。

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三、 aMPV亚型全球历史与美国疫情现状

讲者详细梳理了aMPV四个主要亚型(A, B, C, D)的发现历史和地理分布。

· A亚型 (aMPV-A):1978年首次在南非发现,后传播至欧洲、韩国、墨西哥等地,并于近期在美国和加拿大首次检出。

· B亚型 (aMPV-B):1980年代在欧洲首次发现,现已在欧洲、亚洲(包括中国)、南美多国呈地方性流行,并于近期同样在美国和加拿大首次检出。

· C亚型 (aMPV-C):1996年在美国首次发现,通过疫苗等措施得到有效控制,目前在美国本土基本被清除,但在中国、韩国及部分欧洲国家仍有检出。

· D亚型 (aMPV-D):仅在1985年法国的一份存档样本中被回顾性地发现过一次,此后无任何报道,被认为已不再流行。

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此次美国疫情的特殊性在于,是在C亚型基本“绝迹”多年后,A亚型和B亚型首次同时在美国境内被发现。根据美国农业部动植物卫生检验局(USDA APHIS)于2024年3月发布的通告,2024年1月23日,国家兽医服务实验室(NVSL)首先确认了B亚型的存在;紧接着在2月1日,又确认了A亚型的存在。一份2024年发布的美国火鸡行业健康调查显示,养禽业者已将aMPV列为当前最严重的疾病问题,其关注度甚至超过了高致病性禽流感(HPAI)。

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疫情的扩散速度十分惊人。截至2025年3月,aMPV-A和-B已蔓延至美国至少29个州,覆盖了绝大部分家禽主产区。2024年10月由美国动物健康协会发布的火鸡行业调查再次确认,aMPV被列为头号疾病威胁,凸显了其对产业的巨大冲击。

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四、美国的防控工具:疫苗现状

面对新发疫情,加强生物安全管理是基础,而疫苗接种是控制经济损失的关键工具。然而,由于A、B亚型此前在美国从未流行,美国本土并未研发和储备相关疫苗。疫情暴发后,为解燃眉之急,美国农业部(USDA)批准了多款进口疫苗用于应急防控,主要包括:

· 灭活疫苗:从法国和西班牙进口的B亚型灭活苗。

· 弱毒活疫苗 (MLV):从意大利、西班牙和法国进口的A亚型或B亚型弱毒活疫苗。讲者特别提到,业内普遍认为弱毒活疫苗的效果优于灭活苗。

· 自家苗 (Autogenous):美国本土公司利用分离到的美国毒株紧急生产了B亚型和A亚型的灭活自家苗。

目前,美国尚无基于本土毒株的商品化弱毒活疫苗。

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五、本次研究的目的与方法

基于以上背景,讲者团队开展了此项研究。其核心目的有二:一是系统分析aMPV-A和-B在美国不同禽种、日龄和地区的PCR检测频率,为流行病学提供一手数据;二是尝试分离和鉴定美国本土流行毒株,为后续研究和国产疫苗开发奠定基础。

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研究团队分析了2024年1月至11月间送至爱荷华州立大学兽医诊断实验室(ISU VDL)的2,204份临床样本。在病毒分离方面,他们经历了一个充满挑战的探索过程。初期尝试在常规的Vero细胞系和DF-1细胞系上直接分离病毒,以及通过尿囊腔接种9日龄鸡胚,均以失败告终。最终,通过使用原代鸡胚成纤维细胞(CEF)和原代鸡胚肺细胞(CEL),才成功分离出病毒。随后,团队进一步将分离株在Vero细胞系上进行传代适应,并利用新一代测序(NGS)技术对毒株在传代过程中的基因变异进行了追踪。

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六、研究核心发现

1、PCR检测频率与分布


在2,204份样本中,所有样本的aMPV-C亚型均为阴性,证实了C型在美国的罕见性。数据显示,火鸡样本的总体阳性率(A和/或B亚型)高达51.04%,显著高于鸡样本的15.6%。从年龄分布看,送检的火鸡样本多集中于3-24周龄,而鸡样本多为24周龄以上,这可能反映了不同养殖周期中的采样偏差。

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州际分布呈现出显著的地域差异性,这一发现尤为重要:

· 火鸡样本:在爱荷华州(IA),A亚型远多于B亚型;在俄亥俄州(OH),两者比例相似;而在北卡罗来纳州(NC),B亚型则占据绝对主导。

· 鸡样本:在阿肯色(AR)、密苏里(MO)和俄克拉荷马(OK)等州,A亚型远多于B亚型;在印第安纳(IN)和俄亥俄州(OH),两者比例接近;而在北卡罗来纳州(NC),同样是B亚型占绝对优势。

讲者强调,这些数据源于被动监测,虽不能完全等同于严格的流行病学调查,但清晰地揭示了不同地区的优势流行亚型存在巨大差异。

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从样本类型来看,口咽拭子和气管拭子是最常见的送检样本。对这些样本中阳性结果的Ct值进行分析,可以了解不同亚型在不同禽种中的病毒载量分布情况。

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2、病毒分离的挑战与成功

病毒分离过程的艰难是本次分享的另一个重点。在常规细胞系(Vero, DF-1)和鸡胚尿囊腔接种均失败后,研究团队转向原代细胞。即便如此,成功率依然不高:在49份A亚型强阳性(低Ct值)样本中,仅成功分离出4株;在42份B亚型强阳性样本中,仅成功分离出3株。这充分说明美国新发aMPV毒株对细胞系的挑剔性,以及分离工作的巨大挑战。

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3、毒株的体外适应与鉴定


成功分离是第一步,更关键的是让病毒适应连续传代细胞系以便于后续大量扩增和研究。讲者团队成功地将分离自原代细胞的2株A亚型和2株B亚型毒株,在Vero细胞系中进行了连续传代适应。传代数据显示,病毒滴度和PCR Ct值在传代过程中保持稳定或优化,表明病毒已成功适应Vero细胞。

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在Vero细胞中,成功适应的毒株表现出典型的细胞病变效应(CPE)。

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免疫荧光染色实验揭示了一个有趣的现象:用A亚型阳性血清去染B亚型病毒,或用B亚型阳性血清去染A亚型病毒,均能观察到交叉反应。这一发现提示,尽管A、B亚型在基因上属于不同亚型,但它们在蛋白水平上可能存在一定的抗原交叉性。

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研究团队对传代过程中的病毒进行了全基因组测序,追踪了其核苷酸和氨基酸的变异。结果显示,在从原代细胞到Vero细胞,再到多代传代的过程中,病毒基因组出现了一些非同义突变,但总体变化不大。这为评估其作为疫苗候选株的遗传稳定性提供了重要数据。

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4、进化分析

通过对分离株进行全基因组(WGS)和G基因的系统进化分析,结果清晰地显示,aMPV的A、B、C亚型各自聚为独立的进化分支。本次研究中分离到的美国A、B亚型毒株,分别与各自亚型的全球其他毒株聚在一起。值得注意的是,美国的A亚型毒株与邻国墨西哥近年来的流行株亲缘关系较近,这为追溯病毒来源提供了线索。

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7、结论与展望

张建强教授最后总结道,本次研究系统分析了2024年美国aMPV-A和-B的PCR检测数据,揭示了火鸡的高易感性以及亚型流行强度在不同州之间的显著差异。更重要的是,团队成功地在原代细胞中分离出美国本土流行株,并使其高效适应了Vero细胞系,同时对其传代过程中的遗传变异进行了表征。这些成功分离和适应的毒株,是极其宝贵的生物材料,为未来深入研究病毒的致病机制、评估消毒剂效果、建立动物感染模型以及开发安全有效的本土疫苗,提供了不可或缺的工具和基础。

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冠牧学习心得

· 警惕新发与再发疫情: aMPV A/B亚型在美国的突然暴发和快速蔓延,为全球家禽业敲响了警钟。即使是已多年未见或从未出现过的病原,也可能随时成为主要威胁。家禽兽医在面对呼吸道症状、产蛋下降和肿头综合征时,必须将aMPV纳入鉴别诊断列表。

· 诊断策略需与时俱进: PCR是快速筛查的首选,但诊断实验室在病毒分离时需有充分准备。常规细胞系和鸡胚可能无法满足新型毒株的分离需求,应考虑将原代细胞(如CEF、CEL)作为分离aMPV,尤其是新发毒株的“金标准”方法,并意识到其成功率可能偏低,需要多次尝试。

· 关注区域流行动态: 本次数据显示了aMPV优势亚型存在清晰的地理分布差异(如IA州以A型为主,NC州以B型为主)。这对于指导区域性的精准诊断(如亚型鉴定PCR的设计)和制定疫苗免疫策略至关重要。若未来出现亚型特异性更强的疫苗,区域流行数据将成为选择何种疫苗的核心依据。

· 疫苗研发与应用启示: 讲者团队成功将本土毒株适应于Vero细胞,是开发疫苗的关键一步。其发现的A、B亚型间的抗原交叉反应现象,为评估现有进口B亚型疫苗对A亚型的交叉保护效力,或开发广谱疫苗提供了早期线索,值得进一步通过动物实验验证。

来源:动物疫病动态清零员,方俊博整理






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