《山东畜牧兽医》刊发瑞普生物重磅研究成果，深度解析鸡源鸭疫里默氏杆菌防控新突破！

共享精神 · 发表于 2025-5-15 19:30:00

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案例解析

近日，国内畜牧兽医领域核心期刊《山东畜牧兽医》重点刊发了题为《一株鸡源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及其致病性研究》的学术论文。该研究由瑞普生物家禽解决方案部负责人王友领衔，联合山东省医疗器械和药品包装检验研究院、山东农业大学的禽病防控专家共同完成，在业界引发广泛关注与深入探讨，现将该文章的全文内容转载如下：

摘要一

为探究某蛋鸡群输卵管栓塞的病原学因素，本试验从一例发生输卵管栓塞的蛋鸡中分离到一株细菌并进行鉴定，确认其为血清1型鸭疫里默氏杆菌（Riemerella Anatipestifer, RA）。随后，将该菌株对大日龄蛋鸡进行人工攻毒试验以评估其致病性。动物试验分5组，分别为未免疫+RA攻毒组、未免疫+QX疫苗株/RA攻毒组、RA疫苗免疫+RA攻毒组、未免疫+MS疫苗株/RA攻毒组、未免疫+生理盐水对照组。各组鸡在88日龄和101日龄进行2次攻毒，并在首次攻毒后10天、20天和26天随机剖杀解剖试验鸡。动物试验结果表明，RA攻毒组、QX疫苗株/RA攻毒组、MS疫苗株/RA攻毒组的鸡均出现输卵管栓塞症状，而RA灭活疫苗免疫能够对攻毒鸡起到一定保护作用。该研究结果证明RA是蛋鸡输卵管栓塞问题的重要发病因素，试验结果为蛋鸡输卵管栓塞的防治提供了理论依据。

关键词：蛋鸡；输卵管堵塞；鸭疫里默氏杆菌；分离鉴定；致病性研究

疾病概述二

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一种能够引起鸭、鹅、鸡等水禽和家禽流行性传染性浆膜炎的细菌，由该菌引起的鸭疫里默氏杆菌病主要以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎为特征，部分病例出现关节炎，还可发现共济失调、生长发育迟缓等症状，给养禽业带来严重的经济损失[1]。鸭疫里默氏杆菌病自1932年被首次报道以来，该病已呈世界范围分布，几乎可在所有集约化养鸭生产的国家发现。郭玉璞等于1982年首次在国内鸭场鉴定到RA[2]，此后，在全国许多地区相继有RA发生的报道。一般认为，RA主要危害鸭、鹅等水禽，基本不造成鸡群的发病。然而近年来，鸡源RA相关报道不断增多，鸡场及鸡病诊断工作者对RA的关注度越来越高[3-6]。近期，天津某蛋鸡场94日龄鸡出现严重的纤维素性输卵管栓塞问题。本研究对病鸡进行实验室病原学检测，结果在病鸡输卵管中分离出一株细菌，经革兰氏染色、PCR鉴定及血清分型最终鉴定为血清1型RA。本试验进一步使用蛋鸡对该菌株进行人工攻毒试验，对其致病性进行了系统探究。

材料与方法三

病料来源

天津某规模化蛋鸡场94日龄蛋鸡出现输卵管栓塞症状（图1），采集具有明显病变的输卵管进行病原的检测和分离鉴定。

图1 蛋鸡输卵管干酪物堵塞临床解剖症状

实验动物及毒株

68日龄健康海兰褐蛋鸡购自天津某蛋鸡场，经抗原抗体检测，所用试验鸡未感染禽流感、新城疫、传染性支气管炎、滑液囊支原体等疫病。鸡滑液囊支原体MS活疫苗（109 CCU/mL）、鸡传染性支气管炎QX株活疫苗（2×106 EID50/mL）由天津瑞普生物技术股份有限公司提供。RA灭活疫苗由天津瑞普生物技术股份有限公司制备。

主要试剂

1×PBS、2×Taq Master Mix试剂盒和1×TAE电泳缓冲液购自北京全式金生物技术股份有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂TSA购自海博生物技术有限公司；新生牛血清购自内蒙古维克生生物技术股份有限公司；10种血清型RA阳性血清及阳性菌株由天津瑞普生物技术股份有限公司保存。

细菌分离培养

根据参考文献[7, 8]，无菌蘸取输卵管干酪物，在含有5%牛血清的TSA琼脂培养基上划线，倒置平板分别于37℃微需氧环境下培养24~48h。观察细菌生长情况及其菌落形态特征。选取可疑菌落，用含有5%牛血清的TSA琼脂培养基进行纯化，挑取形态特征一致的单个疑似菌落进行革兰氏染色，镜检观察染色特性和形态。

引物设计及合成

针对鸭疫里默氏杆菌（RA）OmpA基因设计引物[9]，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体引物序列、目的基因和片段大小见表1。

血清型鉴定

吸取1ml TSB（含5%牛血清+1%NAD）培养基于1.5 ml离心管中，接种环灭菌后挑取RA单菌落于离心管中，放入摇床中24h[10]。将培养液1200g离心10min，上清移弃后加入1ml含0.3%甲醛的生理盐水灭活再离心，反复离心2-3次，菌泥加入1ml生理盐水。取不同血清型的单因子血清与菌液在载玻片上等量混匀，出现白色沉淀为该血清型。

动物回归试验

挑选55只饲养至68日龄的健康蛋鸡，随机分5个组，每组各11只，其中每组内10只为试验个体，1只为同居组对照。具体操作如表2所示。其中，E11组仅接种RA，E12组同时接种QX疫苗株和RA，E14组同时接种MS疫苗株和RA，E13组在68日龄先免疫RA灭活疫苗，再接种RA；E15为对照组，接种生理盐水。各组鸡均攻毒两次（88日龄、101日龄）。首次攻毒后10天，每组剖检2只；二次攻毒后7天，每组剖检4只；二次攻毒后13天，每组剖检4只，观察组织器官的病理变化，同时记录动物的临床症状及死亡情况。

结果四

细菌的分离与鉴定

从输卵管干酪物分离到纯净的半透明、边缘整齐、露滴状、乳白色的菌落（图2A）。经革兰氏染色镜检后发现为革兰氏阴性短杆菌，多呈单个状态,部分丝状菌（图2B），菌落形态及革兰氏染色镜检符合RA形态。

图2 鸡源RA的分离与革兰氏染色

A. TSA琼脂培养基所分离的菌落形态；

B. 分离菌株的革兰氏染色（1000×）

PCR鉴定与序列分析

以分离菌的基因组为模板,使用设计的OmpA基因特异性引物进行PCR扩增，获得约为 654 bp的目的条带（图3），与预期大小相符。

图3 OmpA基因的PCR扩增结果

M：DL-2000 DNA相对分子质量标准；

1：OmpA基因片段 2：阳性对照；3：阴性对照；

分离菌株的血清学鉴定

玻片凝集试验结果显示，该分离株RA只与1型鸭疫里默氏杆菌阳性血清反应后出现白色沉淀现象，与2型、4型、5型、6型、7型、10型、11型、12型、18型RA阳性血清均未发生特异性反应，由此确定该分离株为血清1型RA。

人工攻毒试验结果

首次攻毒后10天，E11、E12分别有一只出现输卵管堵塞（图4A，图5A/B）；二次攻毒后7天（首次攻毒后20天），单独接种RA的E11组有一只出现输卵管堵塞（图4B，图5C）；二次攻毒后13天（首次攻毒后26天），E11同居组1只出现输卵管堵塞（图4C，图5D）。此外，单独接种RA的E11组有一只出现呼吸道症状，而QX疫苗株+RA组则有60%（6/10）出现呼吸道症状，MS疫苗株+RA有50%出现呼吸道症状（5/10）。回归试验结果汇总见表3。

图4 攻毒后试验鸡的解剖病变

A. 首次攻毒后10天解剖病变图

B. 二次攻毒后7天（首次攻毒后20天）解剖病变图

C. 二次攻毒后13天（首次攻毒后26天）解剖病变

图5 攻毒后试验鸡输卵管病变

A：首次攻毒后10天，E11组编号2044试验鸡；

B：首次攻毒后10天，E12组编号2048试验鸡；

C：二次攻毒后7天（首次攻毒后20天），E11组编号2126试验鸡；

D：二次攻毒后13天（首次攻毒后26天），E11同居组编号2088试验鸡。剪刀或箭头所示为病变部位。

讨论五

自2023年以来，我国山东、江苏、安徽、天津等地相继出现了蛋鸡群产蛋量下降的临床问题[3,4,6]。经剖检发现，这些鸡群在开产前输卵管中就出现了纤维素性渗出造成的干酪物堵塞的现象，这种堵塞对蛋鸡群产能造成严重不可逆损害。为探究该病的病原学因素，本研究对一例临床发生严重输卵管堵塞的蛋鸡进行了系统实验室诊断。经细菌培养，革兰氏染色，OmpA基因PCR特异性鉴定鉴定，成功从发生输卵管堵塞的蛋鸡输卵管内分离到一株RA。经血清学诊断，确认该菌株为血清1型RA。

众所周知，RA能造成水禽的严重病变，主要表现为头颈震颤、角弓反张等神经症状，剖检病变主要是纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎，部分出现肝脏肿大、脾脏肿大充血及脑膜充血等症状[11, 12]。鸡源RA的致病性如何，目前研究报道较少。为了解该分离株对蛋鸡的致病性，本研究进一步将该株RA接种大日龄蛋鸡进行人工攻毒试验，结果发现单独RA感染即可造成输卵管堵塞病变。为确保本试验结果的可靠性，我们在攻毒前对鸡群肛拭子进行了检测，确保所选择的鸡群无RA感染；同时在攻毒后对病变输卵管进行了细菌分离，再次分离到了RA。上述结果表明，RA是造成临床蛋鸡输卵管堵塞的重要因素。

为更全面模拟生产中的实际情况，本研究在进行RA攻毒的同时，设立了IBV QX疫苗株+RA，以及MS野毒株+RA两个试验组。有观点认为，IBV QX疫苗株和MS疫苗株有可能在输卵管堵塞中发挥一定作用。试验结果与我们预期不完全一致，IBV QX疫苗株和MS疫苗株并未增加试验鸡输卵管栓塞发生的比例，但是这两个试验组鸡只出现呼吸道症状的比例较高。事实上，IBV QX疫苗株和MS疫苗株不易引起大日龄鸡的呼吸道症状。但当RA与IBV QX疫苗株和MS疫苗株联合攻毒后，试验鸡发生了较高比例的呼吸道症状，提示混合感染可能增强了QX疫苗株和MS疫苗株的致病能力。当然也有可能联合攻毒增强了RA对呼吸道的损伤作用，这需要未来更系统的动物试验进行验证。此外，本研究还探究了RA灭活疫苗的保护作用。初步研究表明，RA灭活疫苗有助于预防RA诱发的输卵管堵塞现象，这为未来该病的防控提供了思路和技术支持。

综上所述，本试验在发生输卵管阻塞的蛋鸡中分离到一株血清1型RA。该菌株可诱发大日龄蛋鸡输卵管堵塞，并增强与IBV QX疫苗株和MS疫苗株混合感染时的呼吸道损伤。本研究为兽医工作者在临床诊断中提供有力依据，为RA的防控提供了可行思路和方案。

参考文献六

来源：养殖宝，作者 | 王友段伦涛汪晓飞王一新李培勇冯敬敬王冬雪