Zsuzsa Kreizinger博士：禽支原体耐药性机理与毒株鉴别研究

共享精神

Zsuzsa Kreizinger

苏茜·克雷格 博士

匈牙利HUN-REN兽医研究所

高级研究员

概述

一、支原体的抗生素用药

除了净化和免疫之外，控制禽支原体感染的主要途径就是抗生素用药。抗生素用药可以降低临床症状、减少损失和垂直感染。使用的抗生素主要包括两大类：一类是蛋白质合成抑制剂（抑菌），包括大环内酯类、林可酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、截短侧耳素、苯丙醇（氯霉素类）；一类是核酸合成抑制剂（杀菌），氟喹诺酮类。抗生素用药的缺点是保护时间短，且不能完全清除动物体内的禽支原体。

合理使用抗生素，基于抗生素的药敏试验（MIC）结果用药，规范用药剂量、用药周期等，防止宿主动物体内的支原体和其它病原，特别是人畜共患病病原产生耐药性，避免使用重要的人用抗生素。同时利用主动免疫、保持较好的动物卫生状态等措施以维持抗生素的效力。

常规抗生素药敏试验包括琼脂扩散试验、浓度梯度纸条扩散法药敏试验、琼脂/肉汤稀释试验。使用培养液微量稀释法/琼脂稀释法，测定分离株标准接种量的最小抑菌浓度（MIC）。动物致病性支原体的MIC测定尚无已建立实施的标准。由于支原体的分离培养需要2-5周，支原体的CCU测定需要2周，MIC的检测需要3-8天，因此支原体的MIC测定是一个耗时的过程。MIC50即能抑制50%受试菌生长的最低药物浓度。它反映了一种抗菌药物对特定细菌群体的中等抗菌活性水平。MIC90是能抑制90%受试菌生长的最低药物浓度。它代表了一种抗菌药物对大部分细菌的强效抗菌能力。MIC90值可以为临床确定抗菌药物的治疗剂量范围提供参考。另外，定期进行抗菌药物敏感性测试并分析MIC90值的变化，可以及时发现耐药菌株的出现，为制定合理的抗菌药物使用策略和防控措施提供依据。MIC检测时因观测时间点不同可分为初始MIC和终末MIC。初始MIC，即当不加抗生素的生长对照的颜色与pH终点对照的颜色很好匹配时，显示颜色没有变化的最低抗生素浓度。一般来说，这是常用的MIC值。对于生长缓慢的支原体，可在7天后或14天后记录最终读数，此为终末MIC值，以确定初始MIC的持久性。初始MIC和终末MIC越接近，说明抗生素杀菌活性越好。

用药敏试验进行例行监测，从较大的群体在宽泛的时间范围内收集地区性分离株以判断流行株的耐药性趋势变化，确定敏感适用的药物。但需要注意的是，体外药敏试验结果不能代表药物在体内的杀菌/抑菌效果。其他机制可能会干扰抗生素的敏感性，比如病原对药物的泵出机制、药物失活、病原生物膜的形成。

随着时间的推移，欧洲鸡滑液囊支原体（亦称滑液支原体，Mycoplasma synoviae，MS）流行株对喹诺酮类、大环内酯类耐药性增加，对四环素类和截短侧耳素类保持着体外敏感性；亚洲MS流行株对氟喹诺酮类、大环内酯类、林可霉素和壮观霉素的敏感性降低，出现对氟苯尼考的耐药性，对截短侧耳素类保持着体外敏感性；欧洲鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）流行株对氟喹诺酮类、大环内酯类和林可霉素的敏感性降低，对氧四环素类出现耐药性，对截短侧耳素类保持着体外敏感性；亚洲MG流行株对氟喹诺酮类、大环内酯类、林可霉素和壮观霉素的敏感性降低，对土霉素出现耐药性，对截短侧耳素类保持着体外敏感性。恩诺沙星、土霉素和泰乐菌素对绝大多数地区的耐药菌株的抗菌效力都最低。

支原体的耐药性包括天然/内源性耐药性和获得性耐药性。支原体没有细胞壁，因此抑制细胞壁合成的抗生素（β-内酰胺类、氨基糖苷类、磷霉素）对支原体无作用。支原体的rpoB基因突变使得其对利福平天然耐药。支原体缺少多种代谢途径，导致多粘菌素、磺胺类、第一代喹诺酮类（如萘啶酸和甲氧苄氨嘧啶）对支原体无效。MS的23S rRNA基因突变使得其对14种大环内酯类抗生素（如红霉素）内源性耐药。支原体可以通过泵出机制，降低其体内的抗生素浓度。支原体可以形成生物膜，膜表面的多糖蛋白复合物可以阻止抗生素的进入。不同支原体和同一种支原体的不同分离株的生物膜产生能力不同。且有些支原体的生物膜与耐药性之间没有关联。支原体通过抗生素的靶点变异或者靶点修饰产生对大环内酯类、林可酰胺类、截短侧耳素类、氟喹诺酮类抗生素的耐药性，也通过水平基因转移获得耐药基因。

对流行株耐药性的检测，提供合理的用药选择。规范用药，防止耐药性的产生和耐药株的扩散。推动支原体诊断、耐药检测以及支原体临床用药的标准化。Zsuzsa Kreizinger所在的实验室正在和18个国家的22个实验室一起，建立禽支原体等病原的药敏试验结果判定标准。

二、禽支原体分子分型技术、疫苗株与野毒株鉴别技术

支原体的分子生物学检测诊断技术可以用于病原种属的鉴别、筛选，流行病学调查，基因分型，系统进化树分析，菌株耐药基因的有无和耐药相关基因变异的检测，野毒株和疫苗株的鉴别诊断。根据不同的需要，检测的样本类型包括临床样本、混合菌株、纯化分离株等。用于病原种属鉴别、筛选的方法主要包括常规PCR、实时荧光定量PCR（qPCR）、等温扩增（LAMP）等技术检测病原的特异性靶标，是临床检测诊断应用最广泛的方面，检测样品没有种类限制，需要有合适的阴阳性对照。

开展系统进化树分析和基因分型时，主要针对16S rRNA序列、MLST多靶标串联序列等进行的分析，该分析也可以用于菌株的流行病学调查。如果没有相关菌株的全基因测序和注释数据，则需要将目的基因进行PCR扩增和测序。

开展耐药基因的检测或者耐药相关基因变异的检测、野毒株和疫苗株的鉴别诊断时，可以通过全基因测序、组装和注释，但是此方法价格高、耗时长，快速节约的检测方法主要是针对检测基因位点、差异位点建立的错配扩增突变分析（MAMA）、高分辨率溶解曲线分析（HRM）、PCR或者PCR联合扩增片段测序、qPCR等。Zsuzsa Kreizinger表示，对于现有活疫苗菌株（MG TS-11和MS-H）和野毒株的鉴别检测技术，主要根据疫苗株与澳洲菌株之间的差异选择的检测靶标。

三、笔者观点

笔者认为，现有的基因分型方法大多是针对保守的管家基因，而不是毒力相关基因，因此，分型结果更多的是体现菌株的分离年代和分离地点，尚未有充分的依据用来判定菌株的毒力强弱。

另外，由于我国禽支原体感染率高、流行株差异化较大，且基因型、致病特点与国外多有不同，在开展疫苗株与野毒株鉴别检测时，需要评估已有方法对我国流行株的适用性，同时建议持续对国内禽支原体流行情况开展分子流行病学监测、通过比较基因组学分析国内外流行菌株的演变差异。

听课笔记由江苏省农业科学院兽医研究所徐彬副研究员记录整理，冯志新研究员审核。
特别说明：个人听课理解，未经专家审核。