【分享】与蛋鸡感染滑液囊支原体相关的蛋壳顶端异常

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----美国兽医科学杂志
著作人：1、全恩玉、金钟妮、李海琳、古本相、闵京哲、韩武成、李承白、裴妍智 1、莫钟硕、赵善亨、李昌熙2、莫仁弼
（1、忠北国立大学兽医学院禽病实验室   清州    韩国；2、安维捷·亨茨维尔   亚拉巴马州  美国）

我们对表现出蛋壳顶端异常（EAA）的鸡蛋进行了评估，以了解蛋壳特性的变化，例如强度、厚度和超微结构。通过血清学测定以及从气管和输卵管中分离 MS 来证实MS感染。我们还通过扫描电子显微镜鉴定了乳头层的超微结构变化。虽然鸡蛋的结构似乎完好，但超微结构评估表明受影响的鸡蛋无法恢复以前的质量。据我们所知，这是韩国第一份描述 EAA 发生的报告。

MS是世界范围内发现的一种禽类致病性支原体，可引起鸡的亚临床或临床感染。众所周知，这种微生物会因呼吸道症状、滑膜炎、气囊炎和产蛋量减少而给家禽业带来重大经济损失。MS引起经济损害的规模一直是争论的主题，直到最近，鸡的自然或实验室条件下MS感染导致EAA的可能性被证实。EAA的发生验证了MS对家禽业生产力的直接影响。MS引起的 EAA 可以定义为鸡蛋的异常状态，促进裂纹和破壳的发展。鸡蛋的尖端发生特征性变化，例如蛋壳表面变粗糙、蛋壳变薄和半透明度增加。虽然德国、澳大利亚和荷兰经常报道 EAA 病例，但韩国尚未观察到这种情况。在本研究中，从蛋鸡中分离出与EAA 相关的MS，并进行了血清学分析。从感染的初始阶段到换羽的很长一段时间内，观察到了蛋壳的质量和超微结构的变化。  

京畿道 SH 农场 55 周龄海兰褐蛋鸡产下的蛋，提交给忠北国家禽病实验室，发现蛋壳异常，在卵的尖端发现了不同大小、不同密度的粗糙和深色斑块。当将光照射到鸡蛋上时，可以清楚地识别出将斑块与蛋壳正常部分分开的清晰分界区。在含有EAA的鸡蛋中也观察到变色、斑点和裂纹（图 1 中的 A-D 部分）。观察到 EAA 的 SH 农场的 54 周龄蛋鸡产蛋率在 3 周内从 86% 下降至 79%。破蛋率也从 2.6% 增加到 8.3%，并在 57 周龄时达到峰值，同时死亡率也增加（图 2）。而蛋壳质量的变化可能归因于非感染性因素，但我们进行了实验分析来确认感染的存在。产蛋量的突然变化或鸡蛋顶部特定病变等因素强烈表明鸡蛋质量可能已被传染源改变。

图1。从MS感染的SH农场采集的蛋壳顶端异常（EAA）阳性（B～D、F和G）或阴性的超微结构（E和E）图像。注意在蛋壳的表面存在粗糙和黑暗的区域（B～D）。在蛋壳(D)中明显存在一个特有的区域，当用手电筒照射时，尖端的光穿透增加。未受影响的蛋壳(E)的扫描电子显微镜图像清楚地显示了内膜(a)、乳突层(b)和部分栅栏层(c).带有EAA（F和G）的卵壳缺乏乳突层，只有部分栅栏层存在（箭头）。此外，还观察到更大和更不规则的膜体（mb）。        

   

图2。EAA农场产蛋率和破蛋率的变化。在52周至57周龄的蛋鸡中，蛋产量显著下降，破蛋率增加。由于换羽，68周至71周大的蛋鸡没有生产记录。

蛋壳样品取自SH农场中产有EAA卵的55周龄和77周龄鸡，它们在换羽后未观察到EAA。对血清样本进行了生殖性疾病特异性抗体的筛选以评估感染的可能性。A血凝进行抑制试验以监测禽流感（AI），新城疫 (ND) 和减蛋综合征 (EDS)。针对 AI、ND 和 EDS 的抗体滴度远低于疫苗诱导的滴度。使用商业 ELISA试剂盒筛查传染性支气管炎 (IB)、鸡毒支原体 (MG) 感染和MS。还使用动植物检疫机构提供的抗原进行了额外的快速血清凝集试验，以调查 MG 和 MS 感染。通过 ELISA 测量，55 周龄蛋鸡的 MS 特异性抗体滴度为 13563 ± 5945，77 周龄蛋鸡的 MS 特异性抗体滴度为 6053 ± 2709。这些数据表明蛋鸡感染了MS，并反映出韩国并未常规接种MS疫苗。ELISA未检测到MG 抗体。还对 60 个血清样本进行了 IB 特异性 ELISA。55 周龄蛋鸡和 77 周龄蛋鸡的平均抗体滴度分别为 5871 ± 1981 和 5777 ± 2744。考虑到鸡群的事实 在达到产蛋年龄之前接种IB油苗，滴度水平显示IB野毒感染并未发生。   

为了通过分离MS野毒来确认感染，从鼻孔、喉头和输卵管收集了无菌棉签。MS在支原体培养基中培养。对支原体培养基颜色发生变化（黄色）的样品进行 PCR 扩增 vlhA 基因。使用病毒基因旋转试剂盒提取 DNA。PCR 阳性样本被提交用于基因序列分析。MS是从对55周龄时总共60只蛋鸡中的41只鸡的呼吸道进行了采样。此外，从 55 周龄蛋鸡中选出 20 只鸡，从峡部和子宫部分离出MS。只有一只鸡的峡部和子宫均呈 MS 阳性。第77周时，对60只未产出 EAA 鸡蛋的鸡进行了 MS 调查，其中35只被发现呼吸道 MS 阳性。在选择从输卵管中分离 MS 的 20 只鸡中，没有一只呈阳性。

先前的研究表明，尽管存在蛋壳异常，但输卵管中可能没有病理病变，特别是在原发性MS感染的病例中。vlhA基因序列分析结果显示，从SH农场分离的菌株（KM985992）与Feberwee等之前记录的EAA菌株（FJ495803）不同，缺乏39个核苷酸（nt133～171）。   

为了验证 EAA，对从 SH 农场 55 周龄和 77 周龄蛋鸡采集的鸡蛋进行了蛋壳质量评估。对蛋壳的强度、厚度和超微结构完整性进行了测试。扫描电子显微镜 (SEM) 样品的制备如前所述。55周龄EAA蛋的平均壳厚度为0.34 ± 0.05 mm。这些数据比较，鸡蛋从77周没有EAA的迹象和负面对照组54和64周的鸡没有感染MS或EAA的鸡蛋壳厚度从0.40到0.42毫米。分析结果显示，EAA卵壳厚度的下降有统计学意义。通过蛋壳强度试验，也得到了类似的结果。55周龄EAA（26.95 ± 6.15 N/cm2）鸡的蛋壳强度低于77周龄无EAA和阴性对照鸡(34.55～36.95 N/cm2（34.55～36.95 N/cm2）。EAA卵的壳层强度显著降低（p < 0.01，表1）。

采用扫描电镜法评价蛋层的超微结构。观察到EAA卵的乳突层细节的丢失。这些发现与费伯等人的数据相一致。除了评估乳突层外，还对乳突的改变进行了评估。大部分病变属于Bunk和Balloun 提出的三类。在55周龄鸡的EAA蛋中观察到特定的变化，如乳突体、多核、成核区、海绵状尖端变形（图1中的E-G图）。在77周龄鸡产生的非EAA蛋的超微结构中也存在特异性的EAA相关病变，但没有显示出任何明显的病变。相比之下，77周龄鸟类的非EAA蛋的壳厚度和强度均正常。

表1. 55周龄和77周龄和未感染正常蛋鸡的蛋壳强度和厚度的比较

MS感染	周龄 是否存在EAA	测量
		破碎蛋壳强度（n/cm2）  蛋壳厚度(mm)
感染	55（是）	26.95 ± 6.15a (n = 18)	0.34 ± 0.05a (n = 58)
	77（否）	34.55 ± 11.49b (n = 20)	0.40 ± 0.06b (n = 20)
未感染	54（否）	36.95 ± 8.75b (n = 30)	0.40 ± 0.02b (n = 20)
	64（否）	36.26 ± 10.23b (n = 30)	0.42 ± 0.03b (n = 30)

总之，用血清学试验和MS分离证实了用SH农场产生的EAA蛋。蛋壳质量评价和扫描电镜也显示存在病理改变。目前的案例研究描述了韩国的第一个EAA病例，并揭示了似乎从EAA中恢复的蛋在超微结构水平上仍然存在缺陷。MS输卵管感染与EAA之间的相关性有待进一步研究。   

来源：康德权姜庆丰