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接上期
序列比较和系统发育树构建
从所有阳性样本中获得的 242 bp 部分禽 HEV ORF2 基因 PCR 产物的 32 个序列，命名为 CHN-SX-aHEV-1 至 32，彼此具有 97 至 100% 的核苷酸序列同一性和 76 至 97% 的同一性禽 HEV 的其他 GenBank 参考毒株的序列（表 1）。这些序列与来自美国、欧洲和中国的禽 HEV 基因型 3 分离株具有最高程度的同一性（95-97%）（表 1）。基于序列比对，筛选出CHN-SX-aHEV-1，提交给GenBank（No.MK829812），并用于与从GenBank获得的其他已知禽类HEV毒株构建系统发育树。结果显示CHN-SX-aHEV-1与来自美国、欧洲和中国的禽HEV毒株聚集，属于基因型3禽HEV（图4A）。
表 1。基于 242 个 ORF2 片段碱基，研究中的 32 个禽 HEV 分离株与 GenBank 中已知的不同基因型禽 HEV 毒株之间的百分比同一性 (%)。
分离物
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禽类 HEV 的不同基因型（同一性百分比）
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基因型 1
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基因型 2
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基因型 3
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基因型 4
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CHN-SX-aHEV-1 至 32
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97–100
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82–84
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76–80
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95–97
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81–86
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缩写：HEV，戊型肝炎病毒。
图 4。基于核苷酸序列比对，使用 Lasergene 软件 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 通过 Neighbor-Joining 方法构建系统发育树。(A) 基于禽 HEV (242 bp) 部分 ORF2 基因的树。(B) 基于 ALV-J (964 bp) env 基因的树。给出了每 111 个残基的核苷酸取代数；引导试验的数量设置为 1,000。来自本研究的序列加下划线。
缩写：ALV-J，J avian leukosis virus；HEV，戊型肝炎病毒。
阳性样本的 964 bp PCR 产物的env基因 ALV 序列，命名为 SXXA001 至 SXXA008，彼此共享 96 至 100%，与其他参考 ALV-J 序列具有 91.8 至 95.5% 的同一性，与其他亚组具有 50.1 至 55% 的同一性ALV 序列（表 2）。基于env基因的系统发育树显示 SXXA001 在 ALV-J 组内聚集在一个单独的分支中（图 4 B）。SXXA001序列已提交GenBank，登录号为MK829813。
表 2。基于完整env基因，研究中的 8 个 ALV-J 分离株与 GenBank 中已知的不同 ALV-J 菌株亚组之间的百分比同一性 (%)。
分离物
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ALV 的不同亚组（同一性百分比）
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A
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B
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C
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D
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E
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?
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E/K
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SXXA001 至 008
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96–100
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52–53
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47–48
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52–53
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50.1–51
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53–55
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91.8–95.5
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52–55
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缩写：ALV-J，J 禽白血病病毒。
血清中禽 HEV 和 ALV-J 抗体的检测
使用 iELISA 测试来自鸡群的 480 份血清的抗禽 HEV 抗体，并使用商业 ELISA 试剂盒测试抗 ALV-J 抗体。从表现出产蛋量减少的鸡群中采集的 80 份血清中检测抗禽 HEV 抗体，62 份样本（77.5%）呈阳性（图 5A）。然而，在其他 400 份血清中，没有样品测试为阳性（所有 400 份样品的 OD 450nm值均<0.2，数据未显示）。关于抗 ALV-J 抗体，来自受影响房屋的 80 份血清中，43 份（53.75%）为阳性，所有 43 份抗禽 HEV 抗体也均为阳性（图5B ）。对于其他 400 份血清，抗 ALV-J 抗体检测均为阴性（所有 400 份样品的 S/ P值均<0.2，数据未显示）。
图 5。检测病房鸡血清样本中的禽 HEV 和 ALV-J 抗体。两条线表示用于检测禽 HEV 抗体的 iELISA 和用于检测抗 ALV-J 抗体的商业 ELISA 试剂盒的临界值。(A)每个血清样本的 iELISA 结果的 OD450nm值。(B) 商业 ELISA 试剂盒检测每个血清样本的 S/ P值。
缩写：ALV-J，J avian leukosis virus；HEV，戊型肝炎病毒；iELISA，间接酶联免疫吸附测定。
免疫组化检测
通过 IHC 检测对 11 只选定鸡的肝组织中的禽 HEV 和 ALV-J 进行的检测表明，所有 11 只肝组织在肝细胞中都显示出禽 HEV 阳性细胞质染色信号。图 6A），其中 5 个也呈阳性ALV-J 的细胞质和核染色（图6B ）。因此，IHC 结果与巢式 RT-PCR（禽 HEV RNA）和 PCR（ALV-J 前病毒 DNA）的检测结果一致。
图 6。受感染鸡舍的禽 HEV 和 ALV-J 感染的 IHC 分析。对肝脏进行 IHC 染色以检测禽 HEV (A) 或 ALV-J (B)。(A) 肝细胞胞质和细胞核呈阳性染色；酒吧 = 50 微米。(B) 肝细胞质阳性染色非常明显；酒吧 = 50 微米。
缩写：ALV-J，J avian leukosis virus；HEV，戊型肝炎病毒；IHC，免疫组化。
讨论
中国已有鸡群中禽 HEV 和 ALV-J 感染的报道。关于禽类戊型肝炎病毒感染，据报道，该病毒在中国东部地区的一些鸡群中频繁传播（Su et al., 2019）。不幸的是，虽然 ALV-J 感染现在很少发生在白羽肉鸡身上，但它已逐渐回到中国当地的养鸡场。在之前的一项研究中，据记载，在同一肉鸡和蛋鸡群中检测到抗禽 HEV 和抗 ALV-J 抗体，引发了禽 HEV 和 ALV-J 可能共同感染同一鸡群的猜测。在本研究中，可以在个体鸡中同时检测到禽 HEV RNA 和 ALV-J 前病毒 DNA，这些鸡的肝脏也表现出两种病毒诱导的不同微观病变类型。因此，这些结果证实两种病毒可以共同感染同一只鸡。值得注意的是，这是第一份证明禽 HEV 和 ALV-J 可以自然地共同感染同一只鸡的报告。
在先前描述的野外病例中，在患有 BLS 病、HS 综合征、HRH 综合征和脂肪肝出血综合征的鸡中检测到禽 HEV RNA。然而，在看似健康的鸡中也检测到了 HEV RNA，这引起了人们怀疑禽 HEV 可能不是临床疾病的唯一病原体。?Sun 等，2004）。此外，包括压力、激素或免疫状态以及其他疾病状况在内的其他宿主因素也可能导致疾病爆发（Marlet 等，2018）。在本报告中，Hy-line 蛋鸡群中的禽 HEV 和 ALV-J 混合感染被描述为产蛋量减少 (10-30%)、死亡率增加 (1-3%)、肝出血、坏死和肝肿大。结果表明，禽 HEV 和 ALV-J 的共同感染可导致鸡的 HRH 综合征。然而，需要在实验条件下进行额外的动物实验来确认 HRH 综合征的病原体。
基于系统发育树分析，本研究鉴定的禽类HEV属于基因型3，是中国鉴定出的大多数禽类HEV分离株的基因型。最近，在患有 HRH 综合征的鸡中发现了一种新的禽 HEV 基因型 。然而，该序列尚未从 GenBank 中获得，因此无法将此处获得的禽 HEV 分离株与最近的 HRH 研究中提到的新序列进行比较。关于 ALV-J 感染，由于在中国实施了成功的根除计划，该疾病已在一定程度上得到控制（Zhou et al., 2019）。事实上，近年来本地农场鸡感染的报道很少。然而，在本研究中，在 Hy-line 棕色蛋鸡群中检测到 ALV-J 感染，这表明该疾病可能在中国的一些鸡群和一些地方养鸡场中零星发生。
禽 HEV 和 ALV-J 均可引起鸡的亚临床和持续性感染，给家禽业造成重大经济损失。然而，迄今为止，还没有疫苗或药物可用于预防和治疗这两种疾病。事实上，自 2010 年以来实施的根除计划已经在中国大多数鸡群中预防了 ALV-J 病，仅报告了极少数病例。相比之下，尚未实施此类预防和控制鸡群中禽 HEV 感染的计划，但迫切需要。
本报告记录了中国Hyline棕色蛋鸡群的禽HEV和ALV-J共感染，导致高死亡率、产蛋量减少、明显疾病和组织学可检测到的肝损伤。使用细菌和病毒检测的实验检测方法，我们确定禽 HEV 和 ALV-J 都是此次爆发的原因。需要进一步的体外研究和动物实验来阐明鸡 HEV 和 ALV-J 共感染的发病机制。
来源：鸡保姆，致谢本文原作者：Yani Sun,Qizhong Lu,Jingfei Zhang, Xiaoxuan Li,Jiakai Zhao,Wenqi Fan, Pinpin Ji, Kun Wang, En-Min Zhou, and Qin Zhao，中南山编译整理 |
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发表于 2022-11-5 10:00:00
