传支疫苗-点眼滴鼻还是饮水免疫效果好

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鸡对传染性支气管炎病毒 (IBV) 疫苗的免疫反应可能取决于给药途径、疫苗株和鸡龄。

通常，对于蛋鸡，IBV 疫苗在日龄时通过在孵化场喷雾进行管理，并通过饮用水 (DW) 每隔一段时间用活疫苗加强免疫。对 IBV 减毒活疫苗病毒动力学和产蛋母鸡的免疫反应的了解非常有限。在这里，我们展示了疫苗病毒的传播以及通过 DW 或眼鼻 (ON) 途径接种马萨诸塞或 793B 株后母鸡先天、粘膜、细胞和体液免疫反应的差异。

在早期时间点，大规模接种组中 IBV 的检出率更高，然而，在后期时间点更频繁地检测到 793B。与所有其他接种疫苗的组相比，ON-Mass 的哈德氏腺和鼻甲组织中的病毒 RNA 载量显着更高。两种疫苗血清型在接种后 14 天 (dpv) 的泪液 IgY 水平显着高于对照，并且与 DW 接种组相比，ON 接种组的 IgA mRNA 水平显着高于 DW 接种组，证明了强大的粘膜免疫反应。细胞介导的免疫基因转录物（CD8-α 和 CD8-β）在鼻甲和气管组织中上调。对于这两种疫苗，与 ON 途径相比，由 DW 给予的传播和疫苗病毒清除速度较慢。对于 ON 给药，两种疫苗都诱导了相当水平的粘膜免疫。无论采用 ON 或 DW接种方法，Mass 疫苗都能将细胞免疫诱导至相似水平。

通过眼鼻或饮用水途径接种 Mass (Mass) 或 793B 活疫苗后 41 周龄产蛋母鸡的宿主免疫反应。

IBV 减毒活疫苗用于诱导局部免疫，这对于有效的宿主粘膜免疫反应很重要 ，对日龄雏鸡进行活疫苗接种，然后每隔一段时间接一次，以实现早期和持续的黏膜保护。在产蛋开始前 4-6 周，每只鸡还接受灭活疫苗以提高体液抗体水平。IBV 疫苗接种的金标准方法是眼鼻 (ON) ，然而，这种途径对于给大量鸡群接种疫苗是不切实际的。出于这个原因，在现场，活疫苗通常通过饮用水 、粗喷雾  或气溶胶在日龄或第一周龄 内给药。尽管有关于评估幼鸟活疫苗的出版物，但迄今为止，还没有任何关于在老蛋鸡中使用单价疫苗的影响的报告。













单个 CL 拭子
所有 CL 拭子中的病毒 RNA 载量均低于对照组的检测限。在 Mass-DW 组 (1.911 log REU) 和 793B-DW 组 (2.249 log REU) 中 RNA 水平在 3 dpv 达到峰值。Mass-DW 组的病毒载量从 1 到 3 dpv 显着增加，而 Mass-ON 组的病毒载量从 5 到 14 dpv 显着降低（图 5）。



哈氏腺 (HG)
与其他组相比，ON-Mass 组中 1 和 3 dpv 的病毒载量显着更高（图 6A）。在 5 dpv 时，两个 DW 接种组的病毒载量均明显高于 ON 接种组（图 6A）。在 DW-Mass 接种组中，与其他采样日相比，5 dpv 的病毒拷贝数显着更高。793B 接种组和 ON-Mass 组在 14 dpv 时均为阴性。



鼻甲
与其他时间点相比，所有组在 3 dpv 时的病毒 RNA 载量显着更高，但 ON-Mass 除外。与所有其他组相比，在 1 dpv 接种 ON-Mass 的鸡只的病毒载量显着高于所有其他组，并且在 5 dpv 与 ON 接种组相比，两个 DW 组中的病毒载量显着更高（图 6B  ）。

后庭裂
在大规模接种组和 ON-793B 组中，3 dpv 的病毒载量显着高于所有其他采样日。与 ON-793B 鸡相比，在 5 dpv 时，两个 DW 疫苗接种组的水平显着升高（图 6 C）。

气管
与其他时间点相比，所有组的病毒拷贝数在 3 dpv 时显着更高，但 DW-Mass 除外，它在 5 dpv 时显着更高。此外，与其他组相比，ON-Mass 鸡在 1 和 5 dpv 时显着降低（图 6 D）。

盲肠扁桃体
与所有其他组相比，ON-Mass 组在 14 dpv 的病毒载量显着更高（图 6 E）。没有注意到进一步的显着差异。

肾
对于 793B，DW 和 ON 组在 1 dpv 时均呈 IBV 阳性，而只有 DW-793B 组在 3、5 和 14 dpv 时呈阳性。Mass 组仅在 3 dpv 时为 IBV 阳性，Mass-ON 组在 14 dpv 时为阴性。此外，Mass-DW 组在14 dpv 时显着高于 793B-DW 组（图 6F  ）。

差异 mRNA 表达：TLR3 和 MDA5

哈氏腺 (HG)
与其他组相比，在 DW-793B 和 ON-Mass 鸟类中，通过接种 3 dpv 和 5 dpv 的两种接种途径，在大规模接种的鸟类中 TLR3 的 mRNA 表达显着上调（图 7）。与其他组相比，除了 DW-Mass 组在 3 dpv 时，ON-Mass 鸟类中 MDA5 的表达在 3 dpv 和 5 dpv 时显着上调。



讨论
IBV 减毒活疫苗已广泛用于年轻的商业肉鸡 [ 45 ] 和饲养层/种鸡 [ 46]，并且通常不在产蛋母鸡中使用。尽管如此，近年来，在许多国家，在产蛋鸟类中“无证”使用 IBV 活疫苗的情况有所增加。在文献中，我们没有发现关于传染性支气管炎疫苗病毒的病毒载量或商业产蛋母鸡头部相关淋巴和呼吸道组织中的免疫反应的信息。为了解决这个问题，我们通过两种不同的途径（眼鼻和饮用水）研究了疫苗接种后的病毒载量、先天性、粘膜和细胞免疫反应。我们比较了通过口服途径接种疫苗后与通过眼鼻途径接种疫苗后的反应，因为通过呼吸道途径对禽类进行个体给药通常可以提供最佳的免疫反应和针对许多 IBV 攻击病毒的保护 [ 18]。在全球范围内，越来越多的生产者通过饮用水接种活 IBV 疫苗 [ 47 ]，因为农场工人准备和接种疫苗很方便，而且与鼻内或眼内途径相比，它对鸟类的压力较小，因为减少动物处理。饮用水管理也被认为对呼吸道粘膜的刺激较小，通常对产蛋量几乎没有影响 [ 48 ]。

为了诊断 IBV，通常通过 RT-PCR、qRT-PCR 或病毒分离检查拭子样本（OP 和/或 CL）和组织中的病毒。在这项研究中，在接种 ON 疫苗后，通过 qRT-PCR 每隔一段时间检查单个 OP、CL 和组织样本的病毒载量。与 793B 相比，从 OP 拭子中检测到 Mass 疫苗的时间更短（最多 7 dpv），后者持续时间长达 14 dpv。相比之下，对于 CL 拭子，与仅在 7-14 dpv 检测到的 793B 相比，Mass 疫苗更早检测到，但很少（1、5 和 14 dpv）。早先检测到大规模疫苗，随后检测到 793B 疫苗病毒，此前曾在肉鸡中报道过 [ 49]。在 ON 给药后，两种菌株的病毒载量在 HG、鼻甲、后鼻孔裂、气管、盲肠扁桃体和肾组织中进行了量化，但是，水平因组织类型而异。在 HG、鼻甲、盲肠扁桃体和肾脏中经常发现明显更高的 Mass 疫苗病毒载量。有趣的是，在气管中，在 1 和 5 dpv 时发现了更高的 793B 病毒载量，而在 14 dpv 时均未检测到任何菌株。似乎在大多数组织中，当通过 ON 途径施用时，Mass 疫苗能够比 793B 更有效地建立自身。在 DW 应用后，OP 拭子中的 IBV 检测和 Mass 和 793B 疫苗病毒载量与 ON 给药相似。相比之下，对于 CL 拭子，与 ON 应用相比，Mass 和 793B 疫苗病毒持续检测到更高水平。这可能表明病毒在胃肠道和/或肾组织中的潜在复制。有趣的是，在应用 DW 后，在 HG、鼻甲、后鼻孔裂或盲肠扁桃体中未观察到每种疫苗之间的病毒载量存在显着差异。对于气管，793B 疫苗在 3 dpv 时具有显着更高的病毒载量，而 Mass 疫苗在 5 和 14 dpv 时显示出显着更高的水平。对于肾脏组织，两种疫苗的持续时间都高达 14 dpv，然而，在 3、5 和 14 dpv 时，Mass 明显高于 793B。总体而言，与 793B 相比，在 DW 应用中，Mass 疫苗似乎缓慢地传播到组织中，并且在气管和肾脏中的病毒载量更高时持续存在。在 HG、鼻甲、后鼻孔裂或盲肠扁桃体中未观察到每种疫苗之间的病毒载量有显着差异。对于气管，793B 疫苗在 3 dpv 时具有显着更高的病毒载量，而 Mass 疫苗在 5 和 14 dpv 时显示出显着更高的水平。对于肾脏组织，两种疫苗的持续时间都高达 14 dpv，然而，在 3、5 和 14 dpv 时，Mass 明显高于 793B。总体而言，与 793B 相比，在 DW 应用中，Mass 疫苗似乎缓慢地传播到组织中，并且在气管和肾脏中的病毒载量更高时持续存在。在 HG、鼻甲、后鼻孔裂或盲肠扁桃体中未观察到每种疫苗之间的病毒载量有显着差异。对于气管，793B 疫苗在 3 dpv 时具有显着更高的病毒载量，而 Mass 疫苗在 5 和 14 dpv 时显示出显着更高的水平。对于肾脏组织，两种疫苗的持续时间都高达 14 dpv，然而，在 3、5 和 14 dpv 时，Mass 明显高于 793B。总体而言，与 793B 相比，在 DW 应用中，Mass 疫苗似乎缓慢地传播到组织中，并且在气管和肾脏中的病毒载量更高时持续存在。对于肾脏组织，两种疫苗的持续时间都高达 14 dpv，然而，在 3、5 和 14 dpv 时，Mass 明显高于 793B。总体而言，与 793B 相比，在 DW 应用中，Mass 疫苗似乎缓慢地传播到组织中，并且在气管和肾脏中的病毒载量更高时持续存在。对于肾脏组织，两种疫苗的持续时间都高达 14 dpv，然而，在 3、5 和 14 dpv 时，Mass 明显高于 793B。总体而言，与 793B 相比，在 DW 应用中，Mass 疫苗似乎缓慢地传播到组织中，并且在气管和肾脏中的病毒载量更高时持续存在。

本研究中的所有鸡只在日龄时接种了活 IB Mass 疫苗，在 14 日龄时接种了灭活 IB 793B 疫苗，在 15-18 周龄时接种了 M41 + D274 疫苗 [ 15 , 16 , 17]。在将禽类转移到“全进全出”散养蛋鸡场后，未接种其他活的或死的 IBV 疫苗。在对任一菌株进行 ON 疫苗接种后，与对照组 (4062) 相比，在两个接种组 (Mass-8306.4 和 793B-7998.8) 在 14 dpv 时发现了显着更高水平的体液抗体。与 ON 疫苗接种相比，当疫苗由 DW 接种时，793B 组 (8075) 的抗体水平在 14 dpv 时显着高于 Mass 组 (5464.6)。在产蛋母鸡中，已经表明血清抗 IBV 抗体水平在防止产蛋量和质量下降方面具有显着影响 [ 19 , 46 ]。

对于黏膜免疫，免疫球蛋白 A (IgA) 抗体在提供针对 IBV 的保护方面发挥着重要作用，之前已经报道过泪液中 IBV 特异性 IgA 的水平 [ 53 , 54 , 55 , 56 ]。在这项研究中，通过量化泪液中的 IgA 和 IgY 抗体来评估粘膜免疫。在任何 ON 接种组中均未发现 IBV 特异性 IgA 显着增加。相比之下，通过 DW 给予的大规模疫苗组中的泪液抗 IBV IgA 水平在 14 dpv 时显着增加。以前的研究报告了在日龄 SPF 或肉鸡的眼部和/或 DW 疫苗接种后泪液中 IgA 水平升高 [ 14 , 57 , 58]。高水平的 IBV 特异性 IgA 也与对毒性 IBV [ 14 ] 的一定程度的保护有关。对于 IgY（相当于哺乳动物中的 IgG），泪液中的检测可能是由于渗出 [ 59 ] 和/或 B 细胞的局部分泌 [ 60 ]。在目前的研究中，任何一种疫苗的眼鼻接种似乎都会导致泪液 IgY 显着增加 14 dpv。这可能是由于上呼吸道和淋巴组织（包括 HG）中更多的 IBV 复制和炎症[ 61]。这些结果与 Gallego 等人发现的结果相似。谁证明了通过眼部途径在七周龄鸡中施用可溶性抗原是在 HG 中产生局部免疫反应的有效应用 [ 62 ]。14 dpv 时泪液 IgY 水平显着升高也与体液 IBV 抗体滴度的总体增加相对应 [ 13 , 14 , 51 ]，这反映了 IgY 向泪液中的转导增加。这对于 793B 疫苗似乎尤其如此，因为我们仅在 DW-793B 组中检测到显着的 IgY 水平，而在 DW-Mass 组中没有检测到。局部记忆免疫反应已被证明以 IgY 为主 [ 13]。因此，产蛋母鸡中较高水平的 IgY 将有利于最大限度地减少 IBV 感染，从而避免或减少产蛋损失，并维持良好的整体鸡群健康。

尽管间接 ELISA（如上所述）是测量粘膜免疫的首选方法，但由于几个原因，它并不总是可行的。这包括要求 IgA/IgY 单克隆抗体、IBV 抗原纯化和标准化、可从每只鸡身上收集的少量泪液、费力的气管清洗液收集过程以及包括上呼吸道组织（例如鼻甲）无法收集到液体的地方。由于这些原因，我们还尝试测量鼻甲和气管组织中 IgA 和 IgY mRNA 转录的调节。这允许量化组织样本中的粘膜免疫参数。对于 IgA 或 IgY mRNA 转录的变化，ON 接种组之间的比较显示上调或下调取决于疫苗株和采样时间点。对于大规模接种母鸡的鼻甲组织，IgA 和 IgY mRNA 在所有采样点均下调，而接种 793B 的母鸡在 3（IgA 和 IgY）和 5（IgA）dpv 时显着上调。相反，对于气管，在接种 Mass 或 793B 的母鸡中都发现了 IgA mRNA 的上调，而不是 IgY 的上调。有趣的是，Mass 组中 IgA mRNA 的上调在 5 dpv 时显着高于 793B 组。这可能表明气管中质量和 793B 的一致且更高的复制，而鼻甲似乎支持 793B 的更好复制。这与上述鼻甲和气管组织中的病毒载量数据一致。与 ON 应用相比，DW 给药后气管和鼻甲中的 IgA mRNA 表达在所有采样点均显示下调。这可能是由于疫苗传播缓慢和/或 HG 和呼吸道组织中的病毒载量较低。鼻甲和气管中 IgY mRNA 在 3 dpv 的早期上调似乎与 793B 病毒载量的峰值有关。此外，在同一采样点注意到 IL-6 的增加，表明炎症增加。

在幼年 SPF 和肉仔鸡中，毒性 IBV 感染或疫苗接种后的早期免疫反应已经发表 [ 36 , 63 , 64 ]。在这项研究中，首次报道了 Mass 或 793B 接种的产蛋母鸡早期免疫反应的某些参数。研究结果表明，在 ON 或 DW 接种后，TLR3 的 mRNA 转录在 HG（3-5 dpv）和气管（5 dpv）中显着上调。同样，在 HG 和气管中 MDA5 显着增加。这两种基因的上调转录先前已在 SPF 和肉鸡的呼吸组织中得到证实 [ 61 , 65]。与 793B 组相比，大规模接种的母鸡的转录本明显更高，这反映了 793B 传播和复制可能较慢，以及被宿主识别 [ 66 ]。相反，对于 DW 应用，在质量和 793B 组之间的 HG、鼻甲或气管中并没有一致地注意到幅度或模式的差异。与 ON 相比，当任何一种疫苗由 DW 接种时，这可能与这些组织中较低的病毒载量有关。

尽管细胞介导的免疫 (CMI) 是对 IBV 免疫反应的重要组成部分，但没有关于在产蛋母鸡中进行活 IB 疫苗接种后 CMI 反应的信息。在这项研究中，在应用 ON 之后，与 793B 疫苗相比，Mass 疫苗产生了更强的 CMI 诱导，这可以通过 3-5 dpv 时气管中的 CD8-α 转录物显着升高来证明。这可能是由于大规模疫苗病毒能够更有效地在呼吸道组织中传播和复制。据报道，表达 CD8-α 链的 CD8 + 细胞参与了早期感染期间 IBV 感染细胞的清除 [ 57 , 67 , 68]。Mass ON 组气管中 CD8-α mRNA 在 3-5 dpv 时显着上调（与对照相比），而 793B 仅 5 dpv，再次反映了 Mass 疫苗复制和刺激局部的能力细胞免疫反应。根据这项研究，似乎到 5 dpv，宿主细胞对大规模疫苗接种的反应，无论是由 DW 还是 ON，都具有可比性。

总之，这项研究代表了第一项在产蛋母鸡中评估 Mass 或 793B 减毒活疫苗的病毒载量以及宿主对这些疫苗的免疫反应的研究。本研究表明，IBV 复制模式因组织类型、疫苗株和接种途径而异。对于这两种疫苗，与 ON 途径相比，DW 给予疫苗病毒的传播和清除速度较慢。当通过 ON 途径给予时，两种疫苗都能够诱导相当水平的粘膜免疫。无论采用何种疫苗接种方法，Mass IBV 疫苗都能诱导相似水平的细胞免疫。当由 ON 或 DW 给予时，793B 疫苗可诱导显着更高水平的体液免疫。

来源：鸡保姆，中南山编译整理，致谢本文原作者：Mohammed Al?Rasheed1,2,3, Christopher Ball1 and Kannan Ganapathy

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