分享 | 鸡常见病毒类疾病的检测方法及采样流程

柔嘉

鸡常见病毒类疾病的诊断中，常规PCR、RT-PCR 和荧光定量方法应用最为广泛，其样品主要包括组织样品、棉拭子和FTA卡三种，具有检测流程简单、快速等优点。但由于病毒特点不同、引物设计的差异等原因，存在假阴性、假阳性的干扰，因此多用于病原学的初步诊断，疾病的最终确诊还要依靠病毒分离或动物回归性实验和/或血清学等方法的相互验证。GE医疗的WHATMAN FTA卡可以用于收集、固化、处理、运输和保存DNA样品，对RNA样品也有一定黏附能力，可用于常见禽病样品的收集和承载。

一、样品要求

• 根据主要的剖检症状，做出初步判断，并有倾向性的对能够代表整个鸡群发病特点的、有共性的病变进行取样，以提高检出率；
  

• 多选择发病初期有典型临床症状的病鸡或新鲜死鸡，要尽量保证样品的新鲜和全面；
  

• 通常按鸡只进行采集，一个鸡群/鸡舍相同的病例可以将多个鸡只的样品混合成一份进行检测。用于病毒分离或者PCR检测的组织样品量不是越多越好，更不是越大越好，以避免无病毒增殖部位对样品中病毒含量的稀释，从而降低检出率；
  

• 在采样过程中一定要避免不同样品组间的交叉污染，重视采样器械的消毒(可采用酒精灯灼烧法)；
  

• 用于病毒分离的样品，采集过程中注意避免与消毒剂的接触，保存和运输过程中避免反复冻融，以保证病毒的活性。
  

二、 采样步骤

组织样采集

常规方法剖检鸡只，根据临床症状和组织病变情况，选取具有典型病变特征的组织块或怀疑疾病的目标器官进行采样。用剪刀剪下所需组织样品，投入采样袋中。

疑似神经性病毒疾病要进行头部的解剖，先剪开头顶部的皮肤，剥离后露出颅骨，可看见颅骨表面形成的“十”字架形状的白色线，沿着横线剪断额骨，再沿纵线剪开顶骨至枕骨大孔，掀开头盖骨，暴露出脑内部结构，可观察脑部并取样。

对于特定病变的关节样品，可以褪去皮肤后，将整个关节送检。

液体样品的采集

关节液、脓汁和渗出物(心包积液和腹水等)可用灭菌注射器直接吸取或用灭菌棉拭子采集。

全血的采集：采血前，按1：5体积在灭菌的注射器内吸入灭菌的抗凝剂(肝素或5%的柠檬酸钠)，无菌抽血后缓慢混匀。

拭子样采集

• 采样的种类与数量：依据采样部位不同，拭子样品分为气管拭子、咽拭子、鼻腔拭子和泄殖腔拭子等。样品的数量应满足统计学的要求，用于疫病诊断时，应采集不少于5-10只病死动物样品，并做好复检和留样备份；
• 物品器械：无菌棉签(或商品棉拭子)、PBS保存液或生理盐水、3ml离心管、剪刀、镊子等；
• 采样前准备：采样和保定人员穿戴好防护用品，加PBS保存液1-2mL于无菌离心管；
• 保定：保定人员一手抓住家禽两翅，一手抓住家禽两腿，将头部或泄殖腔朝向采样者；
• 采样：分三种方式：气管拭子、泄殖腔拭子和内脏拭子。
  
  1、气管拭子：采集气管拭子时，一手握住家禽头部，拇指和食指轻捏于对侧上下喙交界处，打开口腔，用拇指控制住舌头，这样就可以看到气管开口，等待鸡只喘气的时机对准正确的气管开口，将棉拭子插入，并上下移动几次。咽拭子、鼻腔拭子只是采样部位不同而已；
  
  2、泄殖腔拭子：采集泄殖腔拭子时，采样者一手扒开泄殖腔周围羽毛，一手取无菌棉签，插入泄殖腔0.5~1.0cm转动2~3圈。将采集好的棉拭子样品放入装有PBS或灭菌的生理盐水的离心管(一个离心管可放3-5个棉拭子，作为一个混合样进行标记和检测)，剪去露出部分，盖紧瓶盖摇匀；
  
  3、 内脏拭子：脏器拭子，脏器表面用高温消毒后，用棉签伸入进行蘸取，取出后将拭子放入PBS或灭菌的生理盐水中进行保存，以替代无法采集运输的脏器组织送检。
  

FTA卡样品采集

• 使用FTA采集样品时可以用镊子夹持病料组织，将切面在FTA卡的样品区域进行按压，使其充分吸收和黏附病料；
• 用注射器将液体样品直接滴在FTA卡的样品区内；
• 将棉拭子样品转载于FTA卡时，将棉拭子粘有样品的一端，在FTA卡样品区，捻、压和摩擦，使样品充分接触样品区；
• 样本不能重叠按压一个地方且不能出圈；风干干燥后才能合上卡片。
  

注意事项

• 采集人员需要穿防护服，戴手套、帽子，采集完后进行场地、解剖台等的消毒，防止病原通过人为扩散；
  

• 器械消毒：多次解剖用到的剪刀、镊子使用前必须消毒(酒精棉擦拭干净后，在酒精灯火焰上烧干，待冷却后使用)；盛放待检样品的容器也要提前灭菌和消毒(如，EP管经高压灭菌)；避免样品间的污染，原则上细菌污染越少越好。
  

三.、样品标记

样品应以样品袋或FTA卡采样区或棉拭子管为单位进行标记，标明采样日期、日龄、样品名称、农场名和鸡舍号等信息。

四、保存

如样品能在采样当天进行检测，可将样品2-8℃保存；如待检时间较长，要将样品置于-20度冷冻保存。注意样品不可反复冻融。FTA卡无需冷冻，室温保存即可。

五、样品包装

采集的样品要用自封袋做好密封，最好能在24小时内专人送达实验室(夏天需4℃左右冷藏)，如不能在24小时内送检，要把样品先行冷冻。

• 样品整合：检查已冷冻且标记好的装有样品的自封袋是否密封严实，再将其装入一个大一点的自封袋内进行整合，封口前，排除多余空气；
• “汉堡打包”：用气泡泡沫紧密包裹样品袋，然后用塑料胶带固定，这种打包法适用于易碎样品和液体样品；
• 泡沫箱准备：泡沫箱底层放置缓冲物，将打包好的样品至于泡沫箱中，四周放入适量冷冻的冰袋以确保整个运输途中样品仍处于低温环境，冰袋数量依运输时间和季节增减；样品上层和其他部位用缓冲物填充，以防止运输途中样品受到剧烈震荡而受损；
• 包装：盖上泡沫箱盖子后，用塑料胶带密封盖子四周。将整个泡沫箱放置于纸箱中，箱内放入送检单，用塑料胶带密封整个箱子。最后用标记笔在箱体标记必要的标识，比如“易碎勿压”、放置的方向等。
  

注：棉拭子样品也适用于上述包装方法； FTA卡样品可以用塑封袋密封包装。

六、用于病毒分离检测的组织样品采集送检的SOP


工具


盛装


保存


包装


采集组织样品


标记


送检单填写


包装/运输
来源：勃林格家禽

剪刀客

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程祥

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