新城疫诊断技术研究进展

少林寺

病毒分离与鉴定

NDV可以在许多细胞培养系统中增殖，而低毒力的毒株也可在其中一部分细胞中增殖。鸡胚是增殖最敏感、最常用的载体，目前在诊断中广泛使用。用于病毒分离的样品可选择感染鸡的粪便、肠内容物、气管拭子或泄殖腔拭子等，也可根据临床症状采集感染明显的其他组织器官。样品采用常规方法处理后尿囊腔接种9日龄～11日龄鸡胚，收集死亡或濒死胚尿囊液，采用血凝试验(HA)检测尿囊液中是否含有病毒。因流感病毒亦可凝集动物红细胞，故还需用NDV标准阳性血清作血凝抑制试验(HI)，若尿囊液的活性被抑制时，则可确定分离出的病毒为新城疫病毒。另外，NDV也可以用多种细胞培养物分离，最好是鸡胚成纤维细胞或鸡胚肾细胞。但是，有些毒株在细胞培养物中不出现规律的细胞病变，血凝滴度也远比鸡胚低。

病毒分离法是新城疫诊断技术中最为准确的方法之一，但费时、费力，诊断成本较高，不适合作为临床快速诊断方法使用。

2　血清学检测技术

2.1　血凝抑制试验

NDV病毒粒子的囊膜上存在血凝素(HA)，能凝集鸡和多种动物的红细胞，同时病毒进入鸡体后，在鸡的血清中能产生抗红细胞凝集素的抗体，抑制血凝现象，所以可以用HA和HI试验对ND进行定性的检测。HA和HI因具有操作简单、不需特殊的仪器等优点，是目前最常用的方法，大多数的鸡场都用HA和HI试验进行抗体监测和用于ND的诊断。但HA和HI试验在操作中，常会因为各种原因(如不同鸡种的红细胞等)造成误差，并且HI在检测低水平的抗体时不够灵敏而缺乏一定的可靠性。

2.2　琼脂凝胶扩散试验

琼脂凝胶扩散试验(agar gel immunodiffusion，AGID)是一种定性的检测方法，操作简便，不需要特殊设备，且有较好的特异性和检出率，故广泛应用于检测病毒抗原和进行毒性鉴定，以及病毒感染或疫苗免疫后的抗体检测。范昆晓等用灭活的含毒尿囊液制备AGID抗原，方法简单、敏感、不散毒，用所制的AGID抗原检测ND沉淀抗体24 h内即可判定结果。李维义等[3]应用PEG平板进行琼脂扩散试验检测NDV抗原，提高了对新城疫抗原的检出率，采用多器官检查和统一判定的方法，对新城疫的检出率为100%，解决了非典型性新城疫诊断困难的难题，方法简单，准确易行，值得推广应用。

2.3　免疫荧光技术

免疫荧光技术(IFA)就是荧光抗体技术，早在1961年就开始用于人类流感的快速诊断。刘健宏等[4]以NDV单抗荧光抗体标记物(FN29-FITC)为试剂，以直接荧光抗体试验检测各种弱毒株疫苗接种，强毒株人工感染和野外病例鸡组织器官切片的NDV抗原，结果证明具有特异性强、灵敏度高、快速、简便等特点。

2.4　乳胶凝集试验

乳胶颗粒具有良好的吸附蛋白等大分子物质的特性，故可用作载体，吸附某种可溶性抗原，检测其相应的抗体，称为乳胶凝集试验(LAT)。邱德新等用硫酸铵沉淀、透析浓缩的鸡NDV抗原致敏乳胶，制成了新城疫病毒乳胶抗原，由此建立了乳胶凝集试验。用所建立的LAT和HI同步检测69份鸡血清，两者的总符合率为94.2%。该法简便、快速、敏感性高、特异性好，且可用于现场检疫，是一种适合基层单位用来检测鸡NDV血清的一种新方法。

2.5　酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)是应用最广泛的一种免疫测定方法，是以物理方法将抗体或抗原吸附在固相载体上进行的免疫酶测定试验。卢建红等[5]以抗NDV单抗夹心ELISA为基础，建立了PEG-ELISA法，并用于临床NDV的检测。黄仕霞等用鸡红细胞凝集解脱法提纯新NDV抗原用于包被酶标板，最适浓度为0.1 μg/孔～8 μg/孔，灵敏度高于HI，两者具有较好的平行关系。吴保成等以SPF鸡抗细胞培养物纯化毒IgG为第二抗体(1∶200～1∶600)，酶标羊抗兔IgG(1∶500)为指示抗体，建立了检测NDV的间接夹心ELISA，阻断试验表明，夹心ELISA诊断NDV是特异的。于圣青等[6]从10株抗鸡特异性单克隆抗体(McAbs)中筛选出2株McAbs-M22和F23，分别用作包被抗体和酶标抗体而建立的McAbs夹心ELISA试验，对提纯NDV的最小检出量为25 ng/mL，并从临床疑似ND的724只病鸡的口腔棉拭样品中共检出阳性502只，其中200个样品与病毒分离试验结果完全一致。黄小波[7]应用dot-ELISA检测ND血清，有很高的敏感性和特异性。但是，ELISA操作步骤复杂，要求包被的抗原必须有较高的纯度，须采用梯度离心提纯的抗原，同时存在着酶结合物的特异性、阳性结果判定标准的确定等有待解决的问题，但与其他血清学相比，ELISA以其敏感性好、特异性强、操作简便、可重复使用、抗原用量少，同时结果便于长期保存，因此特别适合于基层兽医部门和鸡场对ND的血清学诊断和流行病学普查。

2.6　免疫组化技术

免疫组化技术是以辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体，直接浸染组织标本印片或冰冻切片的免疫检测方法，具有快速、准确等特点。其方法是：常规制备组织切片，滴加鸡抗NDV高免血清，PBS振荡，滴加标记的兔抗鸡抗体，最后滴加底物，水洗，轻染苏木素，常规透视，封片，镜检。马吉飞等[8]应用间接免疫酶组化法诊断鹌鹑ND，在人工感染和自然感染病例的肝、肾、脾、十二指肠中检出NDV抗原，取得满意结果。

3　分子生物学诊断技术

随着 NDV分子结构、分子结构与致病性关系、强弱毒株分子结构差异等的研究进展，为新城疫分子水平上的特异性诊断技术，特别是为从病原体检测角度建立特异性诊断技术奠定了基础。

3.1　RT-PCR技术

RT-PCR技术是一种选择性体外扩增DNA或DNA片段的方法，具有特异、快速、灵敏、简便等优点。目前该方法在NDV检测和诊断中的应用也很广泛。Jestin V[9]首先建立了鉴定NDV的RT-PCR方法，以鸡胚来增殖病毒，从感染病毒尿囊液中提取RNA进行RT-PCR，该方法有很高的特异性，能用于NDV的检测和诊断。Angela等[10]报道了采用RT-PCR检测德国最近分离的近200株NDV分离株，结果符合率达90%。RT-PCR方法可以从组织或粪便中直接检测到病毒，无需经鸡胚增殖，并利用PCR产物的酶切分析对野毒株和疫苗进行了鉴别。阎玉河等[12]根据NDV基因结构特点及强、弱毒株F0裂解位点的序列差异设计两对引物，建立了快速诊断ND的RT-PCR技术，该方法具有快速、特异和操作简便等特点，不仅适用于鸡胚的检测，也适用于对病鸡组织匀浆液的检测。黄庚明[13]利用套式RT-PCR检测新城疫病毒核酸，最低检出量为0.3 pg，经核酸杂交验证该法具有很高的特异性和敏感性。谢芝勋等[14]等根据NDV和IBV的基因文库，设计了两对分别与NDV和IBV某段基因互补的引物，用这两对引物对同一样品中NDV和IBV RNA模板进行多重RT-PCR扩增带通过敏感性检测，结果表明该多重RT-PCR最低同时检出10 bp的NDV和100 bp的IBV模板，且克服了一次PCR反应只能诊断一种疾病的缺点，可以从临床样品和环境样品中直接检测到NDV和IBV。王泽霖等[15-16]鉴定新分离毒株的毒力，结果与传统生物学试验完全吻合，但这种方法要求病毒滴度至少在105EID50。唐小飞等[17]根据新城疫病毒基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位的序列差异，设计了区别强、弱毒株的两组引物，建立了迅速鉴别NDV强弱毒株的RT-PCR方法，强、弱毒株分别能扩增出442、671 bp的特异性片段和252、671 bp的通用片段。

由此可见，用RT-PCR方法检测病毒具有快速、灵敏、特异、直观等特性，消除了常规血清学诊断方法中非特异性因素的干扰及敏感性问题，可以直观地从分子生物学水平检测到病毒核酸的存在，已成为临床上检测和诊断疾病的一个重要发展方向。

3.2　核酸探针技术

核酸探针技术是在已经获得的病毒特异片段上标记放射性同位素或生物素作为探针而建立的一种分子杂交诊断方法。Jarecki-Black J C等[18]用放射性同位素标记的核苷酸探针检测了包括强毒、中毒和弱毒在内的14个NDV毒株，都出现了极好的杂交。同时该探针不与禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)杂交，说明该探针是特异的。由于该探针是按照NDV的F基因5′端高度保守的非编码区设计的，共30对碱基，虽然不与其他病原体发生杂交反应，也不能区别疫苗毒株和自然感染毒株。为此， Jarecki-Black J C等[19]又设计了2个探针，该探针长 21个碱基，与强毒株 Texas (GB)的F蛋白裂解位点基因互补，可与 11个速发性毒株、5个中发性毒株的 RNA杂交，而不能与所有 7个弱毒株的RNA杂交，具有重要的应用价值。Oberdorfer等将探针用于 NDV大批量样品的快速检测，引物被设计用于扩增包括裂解位点在内的F基因362对碱基，PCR产物用作特异致病型探针结合的模板，探针用DIG标记，标记的产品用作DIG碱性磷酸酶酶标抗体进行免疫测定。结果所有的PCR扩增都取得了成功，但仍存在由于基因组变异而导致引物不能结合，出现假阴性的可能，这一问题可通过根据新亚型设计新的引物来解决。

3.3　RNA指纹图谱

Mcmillar B C等[20]首先应用RNA指纹图谱法对 NDV RNA进行了分析。其方法是将病毒RNA提纯后，用T1 RNA酶降解产生大小不同寡核苷酸片段，放射性同位素标记后进行垂直双向电泳，再经放射自显影得到特征性RNA指纹图谱，不同的毒株RNA组成和序列有差异，可通过指纹图谱反应出来。随后他们又对多株 NDV进行了指纹图谱分析，确定了其图谱和同源性。Palmieri S等[21]利用此法分析Bl、QUS及 UIS等株，分辨出了约100个寡核苷酸片段，确定了50个～80个片段是共有的。由于该方法放射性污染较大，随后，Palmieri等又对此法进行了改进，原来是在病毒培养过程中掺入同位素，而改进后的方法是在 RNA抽提后，既用 T1 RNA消化，然后用聚核苷酸激酶及同位素在各片段的 5′末端进行标记，这样减少了放射污染的机会，但该法由于操作复杂，所需设备昂贵且可重复性不高，因而后来很少有人应用。

3.4　单克隆抗体技术

Russell P H等[22]最早以Ulster2C弱毒株为抗原研制出针对NDV不同多肽成分的9株单克隆抗体，将NDV的毒株分为A～H 8个群，同一群中的病毒与这些单抗的反应谱相同，大多数具有共同的生物学和流行病学特征。随后，国内外许多学者分别研究出了针对NDV不同特征的单抗，应用于病毒抗原差异的研究。Meulemans G等[23]用两种单抗混合物进行HI试验，发现它们能够高度抑制所有NDV被检株，但与其他血清型的禽副黏病毒代表株不发生交叉反应。Alexander D J等[24]应用一种单抗能在常规HI试验中抑制大多数NDV毒株，但不能抑制近来流行于鸽的变异株。国内在应用单克隆抗体诊断ND上也取得了一定成就。曹殿军等[25]初步选到4株单克隆抗体，这些单克隆抗体对黑龙江地区分离的NDV强毒株有特异性反应，而且能与常用LaSota和V4弱毒株区分。

国内外许多学者对新城疫诊断方法的的研究还在不断地进行中，但由于近几年来新城疫呈现不断增加的趋势，越来越多的非典型病例在不断增加，常规的诊断方法大都不再适合，随着科技的发展，诊断速度快，敏感性高，操作更简便的方法必将应运产生，将为我国有效控制和消灭新城疫提供强有力的保证。

qingdakong

非常的感谢，有这么好的资料，我太高兴了

曹艳子

谢谢~~

李恩昭

很好，很全面，要看就要很认真的多看几遍才能领会真谛，精华。