不同IBD灭活疫苗在1日龄SPF鸡上的免疫效果评价

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       鸡 传 染 性 法 氏 囊 病（infectious bursal disease，IBD）又称甘布罗病，是由鸡传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、高度接触传染性疾病 。邝荣禄于 1979 年在广州首先发现我国存在该病，此后北京、上海、广东等地也发现了该病 。由于该病发病突然、病程短、死亡率高，且可引起鸡体免疫抑制，目前仍然是养鸡业的主要传染病之一。1987 年比利时北部和荷兰南部均发现 IBDV 超强毒株，我国于 1990年后也有报道分离到超强毒株与变异株，给养禽业造成了一定的经济损失 ，同时给本病的防控也带来了难度。

      疫苗免疫仍是目前最常用且最有效的手段之一，国内本病的商业化疫苗众多。常用的有活苗和灭活苗两大类，活苗有全病毒弱毒疫苗（包括抗原抗体复合物疫苗）和基因工程亚单位活载体疫苗；灭活苗有全病毒灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗。灭活苗包括单苗和联苗，主要以联苗使用为主。市场上有多家商品化死苗，但质量孰优孰劣难以主观评判。本试验选用四种商品化 IBD 死苗进行免疫效果评价，现将研究报告如下。

      1材料与方法1.1 疫苗

      4 种商品化疫苗，分别标记为 A ～ D，其中 A 为IBD 亚单位灭活联苗，B ～ D 为全病毒灭活联苗，均购自市场。

      1.2 攻毒毒株

      IBDV BC6/85 株，购自中国兽医药品监察所。

      1.3 实验动物

     1 日龄 SPF 鸡，由购自山东斯帕法斯公司的 SPF 种蛋自行孵化而来。

     1.4 检测试剂

     IBD 标准琼扩抗原，批号 201603，标准阳性血清，批号 201701，购自中国兽医药品监察所；IBD ELISA 抗体检测试剂盒，批号 LN448，购自 IDEXX 公司。

     1.5 方法

     1.5.1 试验设计

     用 54 只 1 日 龄 SPF 鸡， 分 6 组，A-E 组 每 组 10只，F 组 4 只（见表 1）。A ～ D 组分别颈部皮下接种疫苗，0.2mL/ 只，E 组、F 组不免疫。免疫后 14、21、28 日，分别翅下静脉采血，分离血清，测定 IBD 的琼扩抗体、ELISA 抗体。免疫后 30 日，除 F 组外，各组试验鸡用 IBDV 标准强毒 BC6/85 株点眼攻毒 0.1mL（含100BID），各组隔离饲养。每日观察并记录各组试验鸡发病和死亡情况，至攻毒后 96 小时剖杀所有试验鸡，观察法氏囊病变。法氏囊病变的判定标准：法氏囊出现肿大、萎缩、出血、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变。



       1.5.2 IBD 琼扩抗体测定方法

       称取琼脂糖 1g，氯化钠 8g，倒入 100mL 蒸馏水中混匀加热溶解后，将其倒入 90mm 洁净玻璃平皿中，每个平皿 20mL，静置冷却凝固后即为琼脂平板；用梅花打孔器在所制备的琼脂平板上打孔，中心与外周孔径均为3mm，中心孔与外周孔间距也为 3mm，封底后进行加样；中间空加入 IBD 标准琼扩抗原，外周孔分别加入阴性对照、不同倍数稀释的阳性血清、不同倍数稀释的被检血清；标记清楚倒置于湿盒中 37℃孵育 72h 判定结果。阴阳性对照成立的条件下，被检血清与抗原产生沉淀线的最高稀释度即为该血清的 AGP 效价。

       1.5.3 IBD ELISA 抗体测定方法

       按厂家说明书进行。简要步骤如下：试剂回温后进行稀释样品、加样，加样布局标记清楚，加好样品的反应板放 18 ～ 26℃孵育 30min，洗板后加入酶标抗体，18 ～ 26 ℃ 孵 育 30min， 再 次 进 行 洗 板 后 加 入 底 物，18 ～ 26℃避光静置 15min 孵育显色，加入终止液在酶标仪读数后进行计算。

       2结果2.1 抗体检测结果

      免后 14 日仅 D 组可检测到 IBDV ELISA 抗体，抗体阳性率为 80%，其余组抗体均为阴性；免后 21 日 A-D组均检测到抗体，但仅 C 组和 D 组抗体阳性率在 80%以上；免后 28 日抗体阳性率与 21 日情况相同（见图 1）。


     从 ELISA 抗体平均效价（GMT）可看到，无论是免后 21日还是 28 日，D 组最高，C 组次之（见图 2）。



       AGP 抗体与 ELISA 抗体产生情况基本一致。免后14 日 A ～ D 组均可检测到 IBDV AGP 抗体，但阳性率均在 30% 以下；至免疫后 21、28 日，仅 C 组和 D 组抗体阳性率在 80% 以上（见图 3）。



      从 AGP 抗体平均效价（GMT）看，免后 14 ～ 28 日，各组抗体呈逐步上升趋势，但以 D 组抗体水平最高，其次是 C 组（见图 4）。



      2.2 攻毒保护结果

      免后 30 日攻毒，攻毒后 96h 剖杀，观察法氏囊病变。结果空白对照组试验鸡均未见任何临床表现，法氏囊正常（见图 5A）；攻毒对照组试验鸡 100% 发病，出现精神沉郁、羽毛蓬松等临床表现，剖检后法氏囊均有明显病理变化（见图 5B），取法氏囊用固定液固定后进行免疫组化试验均为法氏囊抗原阳性（见图 6A、图 6B）；免疫组呈现不同程度的保护率，其中 C、D 组 100% 保护，A、B 组分别 60%、80% 保护（见图 7）。



       讨论

       3.1 四 种 IBD 灭 活 苗 免 疫 1 日 龄 SPF 鸡， 无 论 是ELISA 抗体、AGP 抗体还是攻毒保护，都呈现出一致的差异：D 苗最好，C 苗次之，A 苗、B 苗较差。这为选择疫苗提供了一定的参考依据。各疫苗存在的这种差异，可能与疫苗中 IBDV 抗原的含量不同相关，也可能与疫苗保存运输的过程相关。

       3.2 IBD 疫苗所产生的 ELISA 抗体水平还是 AGP 抗体水平，都与 IBDV 攻毒保护呈现正相关，这与文献所报道的 IBD 疫苗所产生的 AGP 效价与攻毒保护呈正相关的结论是一致的 。因此，采用 ELISA 和 AGP 方法都可以很好的评价 IBD 灭活疫苗的免疫效果。

参考文献：略

doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2019.11.001

作者：洛阳中科基因检测诊断中心有限公司 晋春霞，肖亚朋，习向锋，杨沛沛，孙哲，王杰，王迎迎，赵坤坤 *，刘守川

来源：《中国动物保健》2019年第11期