禽传染性支气管炎疫苗的开发和挑战

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禽传染性支气管炎疫苗的开发传染性支气管炎病的疫苗4.1减毒活疫苗

IB减毒活疫苗是用于预防IBV野毒感染的第一代疫苗。这类疫苗已经上市多年，可以通过饮水或喷雾的方式免接种。其中一些种类可以在1日龄或1周龄内使用。由于减毒活疫苗的免疫持续时间相对较短,对于生长周期较长的鸡需要在首次免疫2-3周后，使用相同或不同类型的毒株进行加强免疫。虽然世界各地都已经开始使用针对当地流行株开发的IB变异株活疫苗，但是目前大多数IB减毒活疫苗还是Massachusetts型毒株，例如源自荷兰的H120和H52株等。

活疫苗被广泛用于肉鸡、蛋鸡和种鸡的免疫。然而,不同国家批准使用的IBV疫苗株种类可能不同。因为这是根据当地流行病学情况确定的。例如在美国,M41， H120， Arkansas， Delaware， Florida和JMK衍生的疫苗使用最为频繁；在澳大利亚则使用B和C株；在英国/欧洲使用的疫苗株主要包括M41, 4/91和CR88；在荷兰通常使用D274和D1466疫苗。出于运输和成本方面的考虑,在一些商品化的疫苗中，IBV减毒活疫苗会被与其他活疫苗一起制成联苗，例如新支二联活疫苗等。此外IBV活疫苗有时也会和马立克氏病疫苗,传染性法氏囊病疫苗等其他疫苗一同免疫。目前尚不完全清楚这样组合使用是否会影响免疫效果。目前常见的商品化IB减毒活疫苗包括：Mass血清型的Nobilis IB-Ma5(默沙东)；同样属于Mass型，源于荷兰H120株的AviPro IB H120疫苗(罗曼)；793B分支的Nobilis 4-91(默沙东)；同样属于793B分支的Cevac IBird（诗华）；欧洲Gallivac CR88株(梅里亚)；以及属于QX-like IBV的减毒活疫苗POULVAC IB QX(辉瑞)。

减毒活疫苗存在病毒毒力返强，造成组织损伤和受母源抗体干扰等局限性。活疫苗造成的组织损伤可能导致生产性能下降或继发细菌感染,特别是用于1日龄雏鸡免疫时风险更大。有证据表明,尽管通过连续传代52次或120次获得的传支H52疫苗株和H120疫苗株毒力大大降低,这两种疫苗仍然可能在气管造成严重的病理变化并引起发病。使用IBV减毒活疫苗的另一个局限是存在疫苗株与野毒株重组的可能,导致出现新的IBV血清型。有研究证明接种H120减毒活疫苗会促进IBV在肉鸡中的传播，所以接种活疫苗可能会帮助IBV传播和在鸡群中持续存在。为了减少疫苗毒力返强造成的相关问题,研究人员正在探索利用反向遗传技术创建新型疫苗病毒,这种疫苗应对宿主不存在致病潜力,同时具有复制和诱导免疫应答的能力。该方法已在含有强毒M41株S1基因的IB Beaudette株中获得了证明。

4.2灭活疫苗

灭活疫苗可以单独使用或结合IBV减毒活疫苗使用。这类疫苗通常被用于13-18周龄蛋鸡和种鸡的注射免疫。由于灭活疫苗不能在鸡体内复制,因此不会出现毒力返强的风险,也不会导致病理反应。然而与减毒活疫苗相比,灭活疫苗只能诱导免疫鸡在一段时间内产生循环抗体，并不能诱导杀伤性T细胞介导的细胞免疫。因此在大多数情况下,我们需要将灭活疫苗与减毒活疫苗联合起来使用，并且注射很大的剂量，采用高品质佐剂和/或进行多次免疫。这会增加疫苗开发、运输和使用的相关成本,从而限制了该疫苗的应用。灭活疫苗需要注射免疫,这在大型家禽养殖场中实行起来十分困难或根本行不通。同样,注射部位的反应问题也可能导致胴体废弃率增加或品质下降。

4.3重组疫苗
4.3.1病毒载体疫苗

关于使用病毒为载体表达目的基因的研究非常多。值得注意的是,腺病毒载体能够在细胞中持续存在，不会造成病理反应，而且可感染不同类型的组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限，并能够持续释放抗原。此外载体疫苗携带和表达的是具有不同免疫原性的蛋白质亚单位，而不是整个病毒。研究人员已经制出了重组IBV载体疫苗，目前处于试验阶段。试验结果显示这些疫苗可以诱发显著的免疫应答，预防IB的发生。

虽然载体疫苗似乎可以提供有效的免疫应答，并减少IBV减毒活疫苗的RNA突变问题,但是这种技术也存在局限性。例如母源抗体或之前进行的免疫会对活载体本身产生干扰，减少抗原递呈细胞对抗原的摄取，进而降低转入基因的表达和特异性免疫应答。表达的抗原在宿主系统中缺乏适当的蛋白质折叠、糖基化和转译修饰，其构象表位排列可能会改变,从而影响疫苗的免疫原性和有效性。目前在设计和选择重组IBV疫苗时需要特别关注这些因素。最近的研究显示，使用含有IBV-S1糖蛋白的重组腺病毒疫苗可以诱导显著的抗体应答,在使用同源毒株Vic S (血清型B)或异源毒株N1/62(血清型C)进行攻毒后，对气管病变的保护率可达到90-100%。

在载体中同时插入编码IBV抗原蛋白和编码细胞因子的基因能够增强免疫应答。Shi等人表明表达IBV-S1基因和鸡干扰素基因的禽痘病毒疫苗[rFPV-IFNS1]可以增强针对IB的体液免疫和细胞免疫应答,保护鸡只抵抗LX4,LHLJ04XI和LHB等同源和异源IBV的攻击。表达IBV-S1基因与鸡IL-18的重组鸡痘病毒载体疫苗可以显著增加针对IBV的抗体滴度以及CD4+和CD8+免疫反应。同样,表达IBV-S1基因与鸡IL-18的重组鸡痘病毒载体疫苗(rFPV-S1/IL18)可以诱导100%(20/20)的保护,而免疫仅表达S1基因的载体疫苗的鸡群只有75%(15/20)的保护率。

研究显示，当给小鼠口服免疫腺病毒载体疫苗时，母源抗体对载体疫苗的中和效应有所下降。腺病毒载体疫苗也被证明有望用于家禽的口服免疫。口服免疫操作简便而且能够降低注射所带来的应激。虽然口服载体疫苗可以诱导足够强的针对转入基因的特异性抗体应答,但是在达到理想的T细胞免疫应答方面还需要改进。为了避免曾经做过的免疫对载体疫苗的影响，研究者尝试对载体疫苗进行改造和修饰：如提高疫苗剂量,使用纳米颗粒包被,使用双载体(例如痘病毒载体加腺病毒载体)，和/或交换腺病毒的hexon基因。这些研究取得了一定的成功，但在一些感染模型中存在毒性。

慢病毒载体在兽用疫苗中已经有所应用,但以慢病毒为载体的IB疫苗相关研究还很少见。无论如何，想了解一个载体相对于其他载体是否有优势，都需要相应的对比研究。

4.3.2亚单位疫苗和多肽疫苗

这项技术的原理是通过一种或几种病毒成分来诱导特异性免疫应答。亚单位疫苗的抗原是病原体的蛋白质或多糖，而多肽疫苗的抗原是病原体多肽或一部分编码抗原表位的基因组的表达产物。S1蛋白和N蛋白上的表位可分别用于诱导中和抗体和CTL反应。有研究表明,对应S20-S255位氨基酸的人工合成肽可以与多种IBV毒株的多克隆抗体发生反应,从而展示了其用于IB疫苗的潜质。S1蛋白的19-69位以及250位氨基酸序列位于受体结合区，其N端在病毒侵入细胞的过程中发挥作用。

尽管合成肽疫苗的相关研究仍处于实验阶段,这种新型疫苗已被证明在IBV防控中有很好的前景。一些研究人员正致力于研发多抗原表位的多肽疫苗，这种疫苗可同时预防多种血清型的IBV。研究人员最近正在开发基于IBV S1蛋白和N蛋白多个抗原表位的疫苗。抗原表达和免疫分析研究结果显示，这种合成肽疫苗可以诱导显著的体液和细胞免疫应答,在致死性IBV攻击下可以达到80%以上的保护率。另一方面,一个由乳酸菌系统表达的疫苗可以用于口服免疫,据报道其接种后可诱导粘膜免疫应答。

4.3.3质粒DNA疫苗

与含有活载体的重组载体疫苗不同,DNA疫苗使用的是含有编码目的免疫原性蛋白基因的质粒。迄今为止,获得许可的商品化家禽DNA疫苗还非常少。然而这项技术得到了相当大的关注,目前有几个产品正处于不同的研发或试验阶段。科研人员已经研究出了一种基于Arkansas血清型IBV的S1基因，名为pDKArkS1-DP的DNA疫苗。这种疫苗可通过胚内注射的方式进行接种。在胚内接种2周后免疫减毒活疫苗,可以诱导显著的免疫应答，对IBV攻毒后临床症状的保护率为100%。而仅做DNA疫苗胚内接种或减毒活疫苗接种的鸡群在IBV攻毒后的保护率≤80%。

除了胚内接种DNA疫苗,研究人员还评估了其他接种方法的效果。例如,以肌肉注射方式免疫根据S1，S2和N区域设计的脂质体多表位DNA疫苗，可以诱导CD4+ ，CD3 +、CD8 +和CD3 +细胞数量的增加,80%的免疫鸡只获得了保护性免疫反应。表位疫苗的优点包括：可以在一个很小的递呈系统中包含多个免疫原，针对性地诱导抗体和CTL反应。

研究发现，分别编码IBV核蛋白或S1糖蛋白的DNA疫苗在联合表达IL-2或鸡粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)时可以增强疫苗诱导的免疫应答。根据已有研究，在这两种情况下,体液和细胞免疫应答皆显著增强。然而,编码S1蛋白的DNA疫苗产生的免疫应答更强，它表现出了95%的保护率,略高于编码N蛋白的疫苗。在另一项研究中研究人员还开发了一种编码S1蛋白,N蛋白和M蛋白的多价IBV DNA疫苗。已经证明：当使用阳离子脂质体作为载体时，携带每个特定基因的IBV-DNA疫苗的效果和保护力都获得了提高。使用灭活疫苗加强免疫也获得了类似的结果。

DNA疫苗在给药途径上有一定的局限性,因为大多数DNA疫苗都必须通过肌肉注射途径免疫,这在大型集约化家禽养殖场存在一定的困难。然而通过一些改进措施,养殖者可以在孵化厂以胚内注射方式免疫DNA疫苗或者通过饮水免疫，将疫苗制成气雾等方法来克服DNA疫苗免疫途径所面临的问题。将DNA疫苗制成纳米颗粒可以保护疫苗不被酶降解，并增强其在粘膜表面诱导粘膜免疫的作用。因为DNA疫苗可以在母源抗体存在的情况下使用,所以它可以被用来免疫雏鸡，在育雏阶段抵抗IBV感染。DNA疫苗的其他优点包括：同时诱导B细胞和T细胞免疫应答,安全,能够表达多种蛋白,耐热和生产成本低。DNA疫苗可以在短时间内投入生产,从而应对新出现的病毒威胁。此外,可以对DNA疫苗进行细胞因子佐剂修饰，帮助它们更好地预防家禽传染病。

4.4.4反向遗传技术疫苗

采用反向遗传技术开发基因重组疫苗是一种操纵一个或多个病毒基因的技术。这种技术在近年来已经被用于修饰IBV候选疫苗。例如,研究人员最近分别构建了使用有致病性的M41或4/91毒株的S1基因替代BeauR-IBV毒株S1基因的一种重组疫苗。这些变化使得疫苗可以诱导相应的保护性免疫应答，同时新的BeauR毒株没有致病性。Zhou等人采用同样的技术构建了一个经过改造的H120病毒(R-H120)，这个毒株在鸡胚内传代5次后仍然保留了一些生物活性。有趣的是,据报道使用这种疫苗免疫可诱导高水平的血凝抑制(HI)抗体，而且可以产生类似于完整的H120免疫产生的保护水平。反向遗传技术疫苗可以消除减毒活疫苗的毒力返强问题，因而充满发展前景。虽然研发此类疫苗非常困难,但它可能克服机体先前免疫的中和作用。IBV反向遗传减毒活疫苗肯定会带来彻底的变革。但是这些新疫苗是否会增加或减少变异以及病毒选择压力，还需要进一步的研究。图3总结了各种IB疫苗的主要局限。

可兽医

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王日田

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规模肉鸡

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