教你做抗体监测（转载+整理）

一方论道

红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）

疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。
一、实验用设备：
1、离心机   1台*（3000转 离心红细胞）
2、冰箱   1台*（存放抗原）
3、振荡器   1台*（振荡96孔V型板）
4、抗原   新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板   稀释血清 清洗后可重复使用
6、移液器   1把（5-50微升 稀释血清）
7、吸头   和移液器配套使用，不可重复使用
8、小烧瓶   配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用
9、输液管   采血用，用是剪成6-8cm长的短管
10、注射器   2ml，采血用
11、红细胞   非免疫鸡心脏或翅静脉采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠   配制3.8％抗凝剂用
13、重铬酸钾   配制清洁液用
14、硫酸   配制清洁液用
15、吸管   1毫升、10毫升
16、吸耳球 和吸管配套使用
17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）
18、蒸馏水 当地买。清洗96孔V型板、吸头用
19、离心管   离心红细胞用，可用10ml带刻度的玻璃或塑料离心管
20、生理盐水  做血清稀释液用、配制4单位抗原
二、实验前的准备：
1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原（ND抗原可以用弱毒苗代替，AI抗原自己想办法）
2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用（这个可以直接去买配制好的液体）
3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。现用现配。
4.被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。
5.吸管清洁液的配制：使用1%的稀硫酸溶液。水10公斤，硫酸100毫升，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌，操作时必须戴手套，口罩。
6.96孔V型板和微量滴头清洁液的配制：重铬酸钾79克，水1000ml，硫酸100ml，将重铬酸钾磨碎，溶解于水中，然后慢慢加入硫酸100ml，不断搅拌，切不可将重铬酸钾水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作时必须戴手套，口罩。
7.血清稀释液：为灭菌的生理盐水。
三、实验过程：
原理：某些病毒（如新城疫、减蛋、流感）能够与鸡红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验（HI）。
应用：1、检测血清中的抗体水平，确定免疫时机。2、免疫后及时监测，确认免疫效果。3、辅助诊断病毒性疾病。
包括血凝（HA）试验、抗原校正和血凝抑制（HI）试验三步：
（一）血凝（HA）试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价
1、首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25微升。
2、用微量移液器吸取待测抗原25微升于第一孔中并挤压6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25微升。
3、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25微升。
4、置于微量振荡器上振荡1分钟。
5、室温静置30分钟后观察结果。
6、结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如彩图1所示第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256。（不好意思，没有图片）

图1 抗原效价为1：256
（二）4单位抗原校正：
1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。
例：上图1：抗原效价为1：256，HI试验时，25微升抗原稀释液内须含4个凝集单位，则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理盐水。
2、首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升。第一孔不加。
3、用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25微升。
4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔，每孔25微升。
5、于微量振荡器上振荡1分钟。
6、室温静置30分钟后观察结果。
7、结果观察：第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。（没图片）

图2 前三孔为红细胞完全凝集，第四孔为红细胞50％凝集，第五孔为红细胞完全沉淀，说明该次抗原校正成立
（三）血凝抑制（HI）试验：每排孔检查1份血清。步骤如下：
1.用微量移液器先加25微升生理盐水于各孔中。
2.用微量移液器吸取待检血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25微升。最后一孔不稀释，为红细胞对照。
3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25微升。
4.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
5.室温静置20分钟。
6.用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25微升。
7.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
8.室温静置40分钟后观察结果。
四、结果判定：
1）判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示。
见彩图3：
图3 上图抗体结果从上至下依次为：8/7/8/9/8/7/7/6
2）判定标准：
1.新城疫抗体：育雏育成鸡在7以上，产蛋鸡在9以上。
2.H5抗体：抗体值在6以上。
3.H9抗体：抗体值在7以上。
注：低于以上标准，则需要进行免疫。
3)免疫后抗体规律
一般活疫苗免后7-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持2个月。灭活疫苗免后10-15天产生抗体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月。
五、实验后的用具处理：
1、96孔V型反应板的清洗：
新反应板可直接放入清洁液中浸泡24小时，用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物，然后泡在清洁液中，24小时后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，烤干备用。属塑料制品，70℃以下烤干。
2、微量滴头的清洗：
新滴头直接放入清洗液中浸泡，用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中，最少浸泡24小时，捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液，然后在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，放入恒温箱中烤干，备用。属塑料制品，70℃以下烤干。
3、吸管及积液槽的清洗：
将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中，24小时后捞出，用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再冲洗一遍，甩干，吸管放入高温干燥箱中160℃干燥1—2小时后备用，玻璃制品可高温烤干。积液槽放入恒温箱中烘干

孤山沧浪客

楼主不错啊,高手

左华伟

学习了   楼主的用心值得学习  高手

问心无愧

资料很完整，初学者可能看不懂。

任我行

引用第3楼问心无愧于2009-06-30 10:53发表的  :
资料很完整，初学者可能看不懂。 [url=http://bbs.jbzyw.com/job.php?action=topost&tid=52070&pid=481389][/url]

dy小董

引用第2楼左华伟于2009-06-30 10:35发表的  :
学习了   楼主的用心值得学习  高手 [url=http://bbs.jbzyw.com/job.php?action=topost&tid=52070&pid=481379][/url]

19660908

不错、要试试了

lz410826

          

富安大夫

学习了 啊！！！！！

青岛正新种鸡

讲的很好，楼主费心了

一方论道

回8楼，鸡心脏采血适用于小鸡，方法是用左手握住小鸡，使其腹部朝上，用1ml注射器在胸骨形成的三角窝内平行进针，注意避开嗉囊，将针头全部插入，之后注射器前后微动，抽血，初期不易掌握，可以反复几次
静脉采血适用于大鸡，方法是左手握住两翅膀的根部，如果是采右侧翅膀静脉的话，用手掌托起鸡的左背侧部，使其右侧的翅膀向上平行伸展，暴露出静脉，将注射器平行插入静脉，抽血。

87529847

很好！！顶一下

似海禽声

好  ！资料完整  ，  简练  。  是 大家要学习 的啊！            谢了!                                                   

手术刀

哎！可惜没有实验室啊