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[分享] 教你做抗体监测(转载+整理)

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河南新乡
发表于 2009-6-30 09:36:03 | 显示全部楼层 |阅读模式 来自: 中国山西晋中

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红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)

疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一,这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响,良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。因而通过对鸡群进行抗体监测,及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果,为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。通过对广大养殖户的大量调查发现,由于缺乏有效的监测手段,养殖户普遍存在盲目免疫的现象。因此,建立合理的抗体监测制度,开展免疫抗体监测工作,已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。
一、实验用设备:
1、离心机   1台*(3000转 离心红细胞)
2、冰箱   1台*(存放抗原)
3、振荡器   1台*(振荡96孔V型板)
4、抗原   新城疫(ND)、减蛋(EDS)、流感(AI)抗原,从正规厂家进。
5、96孔V型板   稀释血清 清洗后可重复使用
6、移液器   1把(5-50微升 稀释血清)
7、吸头   和移液器配套使用,不可重复使用
8、小烧瓶   配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用
9、输液管   采血用,用是剪成6-8cm长的短管
10、注射器   2ml,采血用
11、红细胞   非免疫鸡心脏或翅静脉采血或免疫鸡也可,但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠   配制3.8%抗凝剂用
13、重铬酸钾   配制清洁液用
14、硫酸   配制清洁液用
15、吸管   1毫升、10毫升
16、吸耳球 和吸管配套使用
17、针头 9*13(采雏鸡)、9*25(采大鸡)
18、蒸馏水 当地买。清洗96孔V型板、吸头用
19、离心管   离心红细胞用,可用10ml带刻度的玻璃或塑料离心管
20、生理盐水  做血清稀释液用、配制4单位抗原
二、实验前的准备:
1.抗原:从指定厂家购买稳定浓缩抗原(ND抗原可以用弱毒苗代替,AI抗原自己想办法)
2.抗凝剂的配制:用天平称量3.8克柠檬酸三钠,溶入100ml生理盐水中,待溶解完全后即可使用(这个可以直接去买配制好的液体)
3.1%红细胞悬液:由鸡心脏或翅静脉采血,放入加有抗凝剂的离心管内(按抗凝剂:全血=1:2的比例),迅速混匀。在离心机中以3000转/分离心5分钟,用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜,将沉淀的红细胞加生理盐水,慢慢混合均匀,再在离心机中3000转/分离心5分钟,弃去上清液,再加生理盐水混匀,如此反复离心4~5次,最后一次离心后的红细胞,弃去上清液,即为红细胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥,然后加入9.9ml的生理盐水,此即1%红细胞悬液。现用现配。
4.被检血清:每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心,待血清析出后备用。
5.吸管清洁液的配制:使用1%的稀硫酸溶液。水10公斤,硫酸100毫升,将硫酸慢慢倒入水中,不断搅拌,操作时必须戴手套,口罩。
6.96孔V型板和微量滴头清洁液的配制:重铬酸钾79克,水1000ml,硫酸100ml,将重铬酸钾磨碎,溶解于水中,然后慢慢加入硫酸100ml,不断搅拌,切不可将重铬酸钾水溶液倒入硫酸中,以防爆炸,操作时必须戴手套,口罩。
7.血清稀释液:为灭菌的生理盐水。
三、实验过程:
原理:某些病毒(如新城疫、减蛋、流感)能够与鸡红细胞发生凝集,此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制,即红细胞凝集抑制试验(HI)。
应用:1、检测血清中的抗体水平,确定免疫时机。2、免疫后及时监测,确认免疫效果。3、辅助诊断病毒性疾病。
包括血凝(HA)试验、抗原校正和血凝抑制(HI)试验三步:
(一)血凝(HA)试验:采用96孔V型反应板,测定抗原效价
1、首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25微升。
2、用微量移液器吸取待测抗原25微升于第一孔中并挤压6次混合,后吸出25微升至第2孔,依次倍比稀释到第11孔,弃去25微升。
3、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔,每孔25微升。
4、置于微量振荡器上振荡1分钟。
5、室温静置30分钟后观察结果。
6、结果观察:将反应板倾斜成45度角,沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝集;如果孔底的红细胞铺平孔底,凝成均匀薄层,倾斜后红细胞不流动,说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数,称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如彩图1所示第8孔红细胞为完全凝集,说明该抗原效价为1:256。(不好意思,没有图片)

图1 抗原效价为1:256
(二)4单位抗原校正:
1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液:即4单位抗原。
例:上图1:抗原效价为1:256,HI试验时,25微升抗原稀释液内须含4个凝集单位,则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原,加入6.4毫升生理盐水。
2、首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升。第一孔不加。
3、用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中,从第二孔开始挤压6次混合,后吸出25微升至第3孔,依次倍比稀释到第5孔,弃去25微升。
4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔,每孔25微升。
5、于微量振荡器上振荡1分钟。
6、室温静置30分钟后观察结果。
7、结果观察:第一、二、三孔为完全凝集,第四孔红细胞为50%沉淀,第五孔为对照完全沉淀,如果出现以上结果,表明所配4单位抗原准确,校正成立。(没图片)

图2 前三孔为红细胞完全凝集,第四孔为红细胞50%凝集,第五孔为红细胞完全沉淀,说明该次抗原校正成立
(三)血凝抑制(HI)试验:每排孔检查1份血清。步骤如下:
1.用微量移液器先加25微升生理盐水于各孔中。
2.用微量移液器吸取待检血清25微升置于第1孔中,然后倍比稀释至第11孔,弃去25微升。最后一孔不稀释,为红细胞对照。
3.用微量移液器吸取配制好的抗原,每孔25微升。
4.置于微量振荡器上振荡1分钟,混合均匀。
5.室温静置20分钟。
6.用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25微升。
7.置于微量振荡器上振荡1分钟,混合均匀。
8.室温静置40分钟后观察结果。
四、结果判定:
1)判定结果:以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度,以2的指数表示。
见彩图3:
图3 上图抗体结果从上至下依次为:8/7/8/9/8/7/7/6
2)判定标准:
1.新城疫抗体:育雏育成鸡在7以上,产蛋鸡在9以上。
2.H5抗体:抗体值在6以上。
3.H9抗体:抗体值在7以上。
注:低于以上标准,则需要进行免疫。
3)免疫后抗体规律
一般活疫苗免后7-10天产生抗体,2-3周抗体到达峰值,可以维持2个月。灭活疫苗免后10-15天产生抗体,3-4周抗体到达峰值,可以维持3-4个月。
五、实验后的用具处理:
1、96孔V型反应板的清洗:
新反应板可直接放入清洁液中浸泡24小时,用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物,然后泡在清洁液中,24小时后捞出,甩掉清洁液,放入流水中冲洗干净后,在蒸馏水中冲洗一遍,甩干,摆放在恒温箱中,烤干备用。属塑料制品,70℃以下烤干。
2、微量滴头的清洗:
新滴头直接放入清洗液中浸泡,用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中,最少浸泡24小时,捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液,然后在蒸馏水中冲洗一遍,甩干,放入恒温箱中烤干,备用。属塑料制品,70℃以下烤干。
3、吸管及积液槽的清洗:
将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中,24小时后捞出,用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再冲洗一遍,甩干,吸管放入高温干燥箱中160℃干燥1—2小时后备用,玻璃制品可高温烤干。积液槽放入恒温箱中烘干

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鸡网学院专科生

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添砖加瓦奖

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云南红河
发表于 2009-6-30 09:42:10 | 显示全部楼层 来自: 中国云南红河哈尼族彝族自治州
楼主不错啊,高手
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鸡网学院高中生

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河北石家庄
发表于 2009-6-30 10:35:24 | 显示全部楼层 来自: 中国河北沧州
学习了   楼主的用心值得学习  高手
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总版主

以真心实意帮助养殖业为己任.

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优秀版主奖添砖加瓦奖优秀会员奖勤劳奉献奖常驻居民奖原创先锋奖社区居民社区明星忠实会员

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河北邢台
发表于 2009-6-30 10:53:21 | 显示全部楼层 来自: 中国河北邢台
资料很完整,初学者可能看不懂。
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鸡网学院讲师

Rank: 9Rank: 9Rank: 9

添砖加瓦奖常驻居民奖勤劳奉献奖社区居民忠实会员

来自
山东青岛
发表于 2009-6-30 12:25:33 | 显示全部楼层 来自: 中国山东青岛
引用第3楼问心无愧于2009-06-30 10:53发表的  :
资料很完整,初学者可能看不懂。 [url=http://bbs.jbzyw.com/job.php?action=topost&tid=52070&pid=481389][/url]
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添砖加瓦奖优秀会员奖常驻居民奖社区居民

来自
河南省驻马店西平
发表于 2009-6-30 12:32:57 | 显示全部楼层 来自: 中国河南周口
引用第2楼左华伟于2009-06-30 10:35发表的  :
学习了   楼主的用心值得学习  高手 [url=http://bbs.jbzyw.com/job.php?action=topost&tid=52070&pid=481379][/url]
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鸡网学院初中生

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来自
安徽阜阳
发表于 2009-6-30 13:08:07 | 显示全部楼层 来自: 中国安徽阜阳
不错、要试试了
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鸡网学院本科生

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添砖加瓦奖

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河南焦作
发表于 2009-6-30 13:56:17 | 显示全部楼层 来自: 中国河南焦作
          
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鸡网学院博士生

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添砖加瓦奖勤劳奉献奖优秀会员奖常驻居民奖社区明星社区居民

来自
山东烟台
发表于 2009-6-30 18:07:24 | 显示全部楼层 来自: 中国山东烟台
鸡心脏或翅静脉采血,具体怎样采呢?
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鸡网学院本科生

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添砖加瓦奖优秀会员奖社区居民

来自
辽宁辽西
发表于 2009-6-30 21:49:15 | 显示全部楼层 来自: 中国辽宁锦州
学习了 啊!!!!!
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海兰褐蛋鸡苗两周成活率99.5糊肛

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原创先锋奖优秀会员奖添砖加瓦奖常驻居民奖社区明星社区居民

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山东青岛
发表于 2009-7-1 07:31:41 | 显示全部楼层 来自: 中国山东青岛
讲的很好,楼主费心了
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鸡网学院专科生

Rank: 5Rank: 5

添砖加瓦奖原创先锋奖社区居民

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河南新乡
 楼主| 发表于 2009-7-1 07:36:03 | 显示全部楼层 来自: 中国山西晋中
回8楼,鸡心脏采血适用于小鸡,方法是用左手握住小鸡,使其腹部朝上,用1ml注射器在胸骨形成的三角窝内平行进针,注意避开嗉囊,将针头全部插入,之后注射器前后微动,抽血,初期不易掌握,可以反复几次
静脉采血适用于大鸡,方法是左手握住两翅膀的根部,如果是采右侧翅膀静脉的话,用手掌托起鸡的左背侧部,使其右侧的翅膀向上平行伸展,暴露出静脉,将注射器平行插入静脉,抽血。
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鸡网学院博士生

Rank: 8Rank: 8

优秀会员奖添砖加瓦奖勤劳奉献奖常驻居民奖

发表于 2009-7-1 12:13:29 | 显示全部楼层 来自: 中国福建泉州
很好!!顶一下
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鸡网学院初中生

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河南郑州
发表于 2009-7-1 16:57:16 | 显示全部楼层 来自: 中国四川资阳
好  !资料完整  ,  简练  。  是 大家要学习 的啊!            谢了!                                                   
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鸡网学院博士生

讨论是为了进步!!!

Rank: 8Rank: 8

优秀会员奖勤劳奉献奖添砖加瓦奖原创先锋奖常驻居民奖社区居民社区明星

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黑龙江
发表于 2009-7-1 21:22:56 | 显示全部楼层 来自: 中国黑龙江哈尔滨
哎!可惜没有实验室啊
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