2019 年上半年检测总结

共享精神

       检测概况

       2019 年 1-6 月份，禽病检测中心共收到鸡（肉鸡、蛋鸡、种鸡），鸭（肉鸭、番鸭、半番鸭），鹅病例 1253 例，涉及辽宁、山东、河南等 19 个省份 53 个地区，主要阳性病原以及送检地统计如下：

重点疫情介绍

H9

       上半年 H9 的感染主体依旧是白羽肉鸡，辽南地区的大连，山东临沂，河南濮阳等地是阳性病例的主要来源。从经济效益上来说，H9N2造成肉鸡生长缓慢和料肉比升高，造成经济损失；从生物安全卫生角度讲，H9N2被认为是其他 AIV 亚型内部基因的供体，产生了许多 AIV 亚型，包括H5N1、H7N9 和 H10N8 病毒等，为后者在大江南北的肆虐提供了助力。但由于 H9N2 在鸡上的感染有相当一部分是以隐性感染的方式呈现，不易发现却依旧排毒，极容易被忽视，进一步增强了H9N2 与鸡群中其他循环禽流感重组到一起的可能，为日后的某型流感大流行埋下隐患。所以，无论从何角度讲，对于 H9N2 的防控都是不容忽视的。

       虽然 H9N2 在肉鸡上的免疫程序非常清晰，但是 20—27 日龄、32—37 日龄这两个日龄段依旧是送检病例较为集中的时期。剖检结果显示 H9 感染病例绝大多数都伴随有包心包肝的症状，且剖开的腹腔伴随有大肠杆菌感染的典型气味，这两者之间是存在协同致病作用的。正是这种复合型感染造成的死淘升高、控制难度和成本增加。

       扬州大学曹丽萍通过将 SPF 鸡分组，以不同顺序接种 H9N2 病毒以及禽源大肠杆菌，连续观察 7 天记录死亡情况，结果显示，与单独接种 H9 或 E.coli 组相比,先 H9 后 E.coli 接种组的死亡率有了明显的提高,同时接种组的死亡率有显著的提高,而先接种 E.coli 再接种 H9,死亡率的变化不明显,表明协同致病程度与 2 种病原接种顺序的先后有关。

       随后进行的细菌动态分布实验表明，试验鸡经气管接种病原性大肠杆菌后，细菌主要在肺中定居并大量繁殖,进入血液,引起全身反应；联合感染大肠杆菌和 H9 后,可使大肠杆菌在肺中定居时间延长。后续进行的超微动态病理分析结果也表明,混合感染组气管和肺的炎症发生时间早于其它单纯感染组,同时恢复也慢,气管粘膜纤毛严重脱落。

      超微结构观察结果为:混合感染组在接种后 4—48h,气管纤毛全部脱落,肺Ⅱ型上皮细胞全部溶解成空泡,只留下Ⅰ型上皮细胞,严重病变持续到接种后 48h,仍可见Ⅱ型上皮细胞细胞器空泡化。

       E.Coli 可引起气管纤毛细胞的损伤,而 H9N2 不仅能破坏气管粘膜的上皮细胞,而且还能损害肺组织中的Ⅱ型上皮细胞。当 E.Coli 与H9N2 混合感染时,气管、肺的病变更为严重。气管粘膜是阻挡微生物入侵的天然屏障,气管上皮粘膜层的纤毛细胞和杯状细胞是功能单位,杯状细胞分泌出的勃液与向前摆动的纤毛成为保护上皮细胞,防御吸入有害物质的第一道防线。曹丽萍的试验中病理学观察表明,E.coli 可引起器官纤毛细胞的损伤,H9N2不仅能破坏气管粘膜的上皮细胞,而且还能损害肺组织中的Ⅱ型上皮细胞。因此当 E.coli 与 H9N2 混合感染时,使鸡的病变加重。

传支

       传支的阳性主体是白羽肉鸡，25—35 日龄发病较为集中，咳嗽、怪叫，剖检支气管栓塞现象较为普遍，同时伴随有肾脏肿胀。现阶段传支主要引起肾脏和呼吸系统病变，生殖系统和消化系统居次要位置。有文章表明白羽肉鸡比其他类型肉鸡更易感染，阳性数占比为85.17%，这是与其生长速度较快、抗病力较差有一定的关系。

      鸡传染性支气管炎病毒基因组 RNA 复制过程中具有不连续性以及ＲＮＡ聚合酶的不完全校对机制，使得 IBV 的基因间容易发生重组和点突变、基因片段的缺失、插入等，使得 IBV 基因组和结构蛋白容易发生变化，产生新的基因型、血清学、免疫型，同时症状多样。单血清型只能对同型感染产生保护，对异型感染只有部分或不产生作用。据报道，目前全世界有 30 余种传支血清型，防控困难。目前流行的传支以类 QX 为主（亦有学者分为 LX4 Cluster Ⅱ），本检测中心收到的阳性病例多来自于辽宁大连，山东潍坊、临沂，安徽宣城等地。流行毒株与 H120、4/91 的 S1 基因同源性仅为 77%左右，流行毒株的同源性在 94.5—98%之间。

      相关学者对现地流行 IBV 毒株与传统疫苗参考株的氨基酸序列进行推导，进行裂解位点分析发现，绝大多数流行株的裂解位点为均为 His-Arg-Arg-Arg-Arg，与疫苗毒株 H120 推导的氨基酸裂解位点Arg-Arg-Phe-Arg-Arg 不同，与国外疫苗 4/91 株裂解位点Arg-Arg-Ser-Arg-Arg 也不相同。说明我国目前流行的主要毒株的裂解位点高度趋同，且与主要疫苗毒株的裂解位点不同。

      Jackwood 等人比较了 55 株 IBV 纤突蛋白裂解位点氨基酸序列，发现其不像正、副粘病毒那样与宿主细胞范围、血清型、致病性有密切关系，在寻找地方分离株与疫苗株相关分离背景时发现，裂解位点为 His-Arg-Arg-Arg-Arg 的多数属于当前流行株，除引起呼吸道症状外，临床上引起的病变多数是肾脏肿大，呈现“花斑肾”症状，而裂解位点为 Arg-Arg-Phe-Arg-Arg 的毒株则相对复杂，有致肌肉病变的4/91，也有嗜呼吸潜型的H120，由此判断，裂解位点与组织的亲嗜性、血清型以及致病性等方面是否存在明确的相关性还需要进一步研究。

腺病毒

      重点介绍一例来自安徽的番鸭感染病例，通过测序发现该病原属于鸭腺病毒 2 型（DAdV-2 ,B2）（图 6），与 18 年 9 月份在当地分离的毒株同源性极高，表明该型毒株在当地一直有流行。福建农林大学的相关学者发现该病对安徽、福建、浙江、广东的番鸭养殖构成一定的威胁，发病率为 40%—55%，死亡率为 35%—43%。

       该病以肝、肾肿大出血为典型症状（图 7），对感染死亡番鸭病例的相关脏器制作病理切片，结果显示：①肝脏充血，肝细胞间充满红细胞；肝细胞肿胀变形，胞浆内可见圆形或不规则的空泡②心肌纤维水肿，稍显粗糙③肾脏充血，炎性细胞聚集，肾小管上皮细胞肿胀变形部分坏死。

       相关研究表明，肝脏是 DAdV-2 的一个靶向器官，病毒在肝细胞核中进行合成和组装。通过透射电镜确实可以在肝细胞核中观察到大量二十面体的、无包膜的病毒颗粒，其直径为 60 ~ 80 纳米（图 9）。

      从狭义上来讲，短喙侏儒综合征病毒也可以叫鸭源新型小鹅瘟，对樱桃谷肉鸭、半番鸭有广泛的组织嗜性（本检测中心检出的阳性病例都为樱桃谷肉鸭），引起个体发育缓慢，羽毛松乱稀疏，大群发育不均（小鸭比例可占到 30%以上），这一点与鸭圆环临床症状非常相似，眼观无法做出区分，而且在从检测结果来看，两者混感的情况可占到八成以上，据此，将两者放在一起进行表述。其实就短喙侏儒综合征的经典症状而言，单纯的新型小鹅瘟无法进行高效率的复制，而 两者混合感染的几率又非常之高，所以可以认为短喙侏儒综合征是由鸭源新型小鹅瘟病毒占一定的主导地位，与鸭圆环病毒协同致病的。

      本检测中心检测到的短喙侏儒综合征的阳性病例的发病日龄绝大多数都 30—40 日龄之间，之前也零星有小鸭挑出，最小的病例在7 日龄，表现出脱水的症状。对安徽阜阳、安庆等地区的弱鸭苗进行新型小鹅瘟和圆环病毒的检测发现，1 日龄鸭苗即可检出圆环病毒，表现为进苗前三天不爱动，吃、喝较少，4—5 天后开始死亡，死亡率在 10%—20%，也表现出干脚、严重脱水，剖检没有发现明显症状。虽然在相关的送检种蛋中没有检出过圆环病毒，但 1 日龄带毒这种病例也可以进行圆环病毒能进行垂直传播的推测。而且山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室也已做过相关的实验。

      因为短喙侏儒综合征很大程度上是一种由鸭源新型小鹅瘟和圆环病毒混合感染而导致疫病，需从抗体防疫、饲养管理和环控等多个方面进行关注。关于新型小鹅瘟的防治目前是以抗体为主，相关抗体产品需添加流行毒株，这里不再赘述。圆环目前还没有商品苗面世，但是不少学者已经开始了相关的前期工作，并取得了一定的成果。

      DuCV 是无囊膜单链环状 DNA 病毒，基因组约 1.9 kb 。有三个主要的开放阅读框架。ORF1 编码一种 33.6 kDa 的复制酶蛋白(Rep)。ORF3 编码具有凋亡活性的 ORF3 蛋白。ORF2 编码 29.7 kDa 的衣壳(Cap)蛋白，是 DuCV 唯一的结构蛋白。Cap 蛋白是 DuCV 的主要免疫原蛋白，它可以用来制备疫苗。

       DNA 疫苗可在抗原呈递细胞(APCs)中表达靶蛋白，同时 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞从而刺激宿主产生全身免疫。许多研究已表明，DNA 疫苗可诱发机体产生保护性免疫反应。

       四川农业大学的黄娟（音译）以 pcDNA3.1 为载体，构建了编码病毒 Cap 蛋白三种形式的重组质粒，分别是含有全长 Cap 基因的pcDNA3.1-Cap，缺失 Cap 基因核定位信号(NLS)肽编码序列的pcDNA3.1-CapΔNLS 和缺失 NLS 但添加编码组织纤溶酶原激活物(tPA)片段这一分泌信号肽片段的 pcDNA3.1-tPA-CapΔNLS。DuCVCap 蛋白的 N 端核定位信号(NLS)区域(1-17 aa 和 18-36 aa)，其对 Cap蛋白的体外的分布有较大影响。组织纤溶酶原激活物(tPA)作为一种异种信号序列可以驱动靶细胞蛋白进入细胞分泌途径，有效地促进蛋白质从内质网运输到高尔基体，并增强抗原的分泌，三个质粒均可表达相关的蛋白。缺失 Cap 基因 NLS 编码序列能改变衣壳蛋白 Cap 从细胞核到细胞质的位置。PCV2 DNA 疫苗结果表明，tPA 具有良好的免疫原性在 pcDNA3.1-tPA-CapΔNLS 转染的细胞中有 Cap 蛋白的分泌。

      作者通过将上述疫苗与 PBS 以及载体对照组免疫 3 日龄鸭群，每组鸭子大腿外侧肌接种 2 次，两次间间隔 2 周，分别于免疫后 0、1、2、3、4、5、6、8 周收集血清。结果显示三者都在免疫后三周抗体达到可检测水平，pcDNA3.1-Cap 诱导的抗体水平高于 pcDNA3.1- CapΔNLS，但以 pcDNA3.1-tPA-CapΔNLS 的抗体水平最高（图 10）。

       为比较 Cap DNA 疫苗的保护能力，作者对临床症状进行记录，称重鸟类主要免疫器官，攻毒后 4 周进行测量病毒在脾脏滴度。

       在 这 项 研 究 中 ， pcDNA3.1-Cap ， pcDNA3.1-CapΔNLS 和 pcDNA3.1-tPA-CapΔNLS 免疫组在攻毒后没有羽毛凌乱。而 PBS 组 和 pcDNA3.1 载体组表现出羽化凌乱，尤其从 3 周开始背部脱落严重下降。

       攻毒后，所有组的鸭子都没有体重减轻现象和死亡。攻毒后第 4周，各免疫组鸭只与健康鸭的免疫器官重量之间无明显差异。而 PBS和 pcDNA3.1 载体组鸭只的脾脏、法氏囊、胸腺、哈德式腺在攻毒后 4 周出现肿胀，明显重于免疫组（图 11）。

       最后，作者通过采用 qPCR 技术检测攻毒 4 周后脾脏中 DuCV 的滴度。PBS pcDNA3.1 载体组均可检测到 DuCV。pcDNA3.1-CapΔNLS 疫苗组检出 4 只，pcDNA3.1-Cap 疫苗组检出 2 只，pcDNA3.1-tPA-CapΔNLS 疫苗组检出 1 只。因此，PBS，pcDNA3.1、pcDNA3.1-Cap，pcDNA3.1-CapΔNLS， pcDNA3.1-tPA-CapΔNLS 的保护率分别是 0%,0%、80%、60%及 90%（图 12）。

来源：信得科技

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