禽传染性支气管炎疫苗的研究进展

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禽传染性支气管炎疫苗的研究进展  

     禽传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis）是鸡的一种急性、高度接触传染性疾病，其特征为病鸡咳嗽、喷嚏，气管罗音；幼鸡流鼻液；蛋鸡产蛋数量和品质下降；肾型病鸡肾脏肿大、苍白，有大量尿酸盐沉积等[1]。禽传染性支气管炎首先在1931年报道于美国，1936年确定本病病原为病毒，1937年该病毒在鸡胚中传代成功。随后在许多国家和地区均有该病的报道。自邝荣禄 [28]报道本病之后在我国广泛流行。该病目前严重危害世界养禽业的重大传染病之一[49]。IBV（Infectious Bronchitis Virus）是冠状病毒科冠状病毒属的代表种[1]，其抗原性也异常复杂，目前世界上分离的IBV临床毒株已有100多株,分属26种以上血清型[6]。IBV不同毒株结构是不均一的，在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，不同血清型毒株之间交叉保护力弱[6，18，22]；由于IBV血清型的多样性，用常规疫苗H120、H52 、MA5等单一毒株疫苗，已常有免疫失败的报道，采用不同类型毒株制备多价灭活苗便成为预防IB的更有效途径[34]。随着IBV分子生物学研究、免疫机制探索以及病原变异机制探讨等工作的逐步深入，IB疫苗研究工作也取得了一系列进展。本文综述如下：
　
一、IB灭活疫苗
Gough[50]、Box [51]等1977年就报道了用油乳剂灭活苗使IB得到有效控制，但是，这并没能阻止IBV变异株引起IB的暴发[26,27]。随后，Finney（1990）等[52]研究表明IB二价苗能刺激良好的抗体反应；王红宁[26]、张联盟[37]等1994年试制出传染性支气管炎（呼吸型、肾型）多价油乳剂灭活疫苗；经区域试验证明,该疫苗对鸡安全无副作用,并能有效地预防肾型IB，提高肾型传染性支气管炎疫区鸡群的成活率和生产效益[41]。灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，且能激发良好的体液免疫反应。灭活疫苗的不足之处是使用剂量大，需要配合佐剂，制备比较复杂，因而成本较高。J.K.COOK(1991) [24]、王秀清等[43]系列研究证实在IBV的免疫保护中，体液免疫和细胞免疫占有重要地位，认为IB的疫苗预防将使用弱毒疫苗进行滴鼻和使用灭活苗进行注射结合起来。王红宁等[48]通过试验研究认为[48]用弱毒H120滴鼻与多价苗注射结合是预防IB更有效的方法。
　
二、IB弱毒疫苗
弱毒疫苗是由抗原性很好的毒株连续通过鸡胚25代以上获得的。一般认为Massachu-sette型IBV是世界范围内分布最广泛的血清型，且马萨诸塞型能对异型毒株也产生较好的免疫力，该血清型的H52、H120和Ma5致弱活毒疫苗株为绝大多数国家所采用[14]。其次是Conn疫苗株。
活疫苗常常能有效地刺激机体的免疫系统，激发体液免疫和细胞两种免疫力；同时使用较为方便，许多可用作群体免疫（饮水免疫和喷雾免疫），此外这类疫苗的生产成本较低。然而，活疫苗也有其不足之处，其致弱程度难以掌握；疫苗的运输、贮存和使用等的条件要求较高。另一个主要问题是疫苗株有一定的致病性和传播能力，接种疫苗后引起轻度的
　
呼吸道反应。并且当鸡群中存在致病性支原体时，会成为慢性呼吸道病暴发的激发因素[1]。IBV RNA基因组具有独特的先导引物转录机制[5]，加之RNA聚合酶在转录过程中缺乏校对功能，在基因组复制时容易出现差错，使得基因组的每一轮复制都有可能诱发一至数个碱基发生突变，多株弱毒苗的使用，有可能引起 基因重组而出现新的变异毒株甚至强毒株。这使得致弱活毒疫苗在理论和实践上都不可能从根本上彻底控制IB的流行[1，14，15]。
　
三、IB基因工程疫苗
S1基因是IBV的主要免疫原基因[8，46]，采用核酸重组方法研制新型、高效、无毒的IBV基因工程疫苗是近年来IB研究中的一个重要方面。杆状病毒表达系统以其独特的优点倍受重视，杆状病毒对人、畜安全、不污染环境，此外，它还具有以下优点：具有完备的翻译后加工修饰系统；具有高效表达外源基因的能力；外源基因在重组病毒中比较稳定；可插入高达100kb的外源基因；有效表达剪接基因；操作方便；经济效益明显，可大规模人工饲养寄主昆虫，从而获得大量低成本高价值的外源基因表达产物。
宋延福等已将IBV的主要免疫原基因S1克隆到形成多角体的杆状病毒表达载体并构建出两个表达质粒：pSX-IVVI+X3-S1．Hotle 和pSX-IVVI+X3/4-S1．Hotle，S1基因在两个质粒中的翻译起始位点及起始位点的周围环境不同，将影响S1基因的表达水平[11]。
廖明等将IBVHotle S1基因正确地插入到TnNPV基因组中构成两个重组毒株：TnNPV-（X3）S1．Hotle-OCC+、TnNPV-（X3/4）S1．Hotle-OCC+，后者使S1基因在昆虫细胞中得到了高效表达。重组S1蛋白能够被鸡抗IBV血清特异识别，说明它具有类似天然蛋白的生物活性，这对今后研制鸡传染性支气管炎基因工程疫苗意义重大。
黄亚东[21]等已构建了含IBV GD6株S1基因的大肠杆菌重组表达载体pET-S1，转化受体菌BL21，经筛选获得重组IBV S1基因工程菌株。重组菌株经IPTG诱导，通过SDS-PAGE分析，检测出IBV GD6株S1基因在大肠杆菌中获得表达。又将抗菌肽（Cecropin） AD基因和IBV S1基因进行拼接后的双价基因重组到甲醇营养型酵母表达载体中，转化于酵母中获得转化酵母GSCADS2，利用非融合表达策略在酵母中同步表达抗菌肽和IBV S1蛋白。结果IBV S1基因在胞内亦获得同步表达[44]。
几乎所有的亚单位表达产物均出现N-糖基化不完全却值得探讨[12,45]。同时，已有的研究表明，灭活的IBV或S1亚单位疫苗必须经3-4次反复加强免疫方可形成确实的免疫保护[8，9]。IB基因工程疫苗的实用化还有待进一步研究。
　
四、IB活载体疫苗
Binns等[38](1986)利用鸡痘病毒作载体研制出了IBV活载体疫苗。这种疫苗可产生 S1蛋白质。通过监测其在鸡体内复制的无害性，以及它所激发抗IBV保护性免疫应答的能力，均获得满意的结果。Tomley[40]用Beaudette株纤突蛋白基因和痘苗病毒WR株重组，得到了能感染细胞产生含有S1和S2亚基的糖基化的180KD的多肽前体的重组病毒；此多肽免疫小鼠产生的抗体经ELISA检测为针对IBV纤突抗原的能中和IBV对培养的气管环纤毛细胞的致病作用。利用分子生物学遗传工程技术可以更有目的地获得稳定而无致病性的细菌和病毒。如利用该项新技术能在各种载体系统中插入种种保护性抗原基因，经修饰的载体微生物能表达编码致病性微生物保护性抗原的外源性基因。无论是细菌性或病毒性载体，均同时具有活疫苗和死疫苗的优点，同时也具有亚单位疫苗的安全性和或疫苗的有效性的优点。此外，其生产成本与生产或疫苗的成本相同。目前，包括我国在内，全球已有多个研究单位在致力于适合IB免疫的疫苗载体和活载体疫苗的研究 [7]。但考虑到IBV Sl蛋白具有很高的突变率[39]，因此活载体疫苗的保护范围还值得进一步研究。
　
五、IBV DNA疫苗
DNA疫苗具有一般重组病毒活载体疫苗抗原合成和提呈类似自然感染的优点，同时又克服了基因工程活载体疫苗载体系统背景抗原庞大、复杂和免疫刺激持续时间短暂的缺陷，在安全性和有效性上具有突出的优点[16，17]。
步志高等（1998）[23]，以克隆的国内类M41地方流行株IBV纤突糖蛋白S1基因为免疫原基因，构建了DNA免疫表达质粒，并对其免疫原性进行了初步分析。结果表明，该表达质粒可同时诱导机体形成针对IBV的细胞免疫和体液免疫反应。由于S1经骨骼肌细胞内源性表达后主要通过MHC Ⅰ类分子提呈抗原，特别有利于CD8+细胞毒T淋巴细胞的激活，对IBV免疫保护极有意义[19，20]。已经证实我国存在着Mass基因型强毒株的流行。本研究初步表明，以国内类M41强毒分离株IBV的S1基因构建的DNA免疫表达质粒具有良好的免疫原性，有希望取代普遍采用的H52和H120弱毒苗应用于我国IB的免疫预防。
　
讨论及结论
IBV在RNA转录过程中具有很高的错配率（10-３）而又缺乏矫正机制 [29,30]。在不同地区受免疫接种程序、家禽密度等因素的影响下，IBV正以不同的速度和不同的进化方向发生变异 [3]。而IBV的分子变异主要发生在纤突蛋白S1基因[29]。Li等[25](1993)在得克萨斯分离到一株IBV桺P14。该病毒可在用 M41免疫的鸡群中引起鸡严重的呼吸道病。经过对 PP14 Sl基因克隆和测序表明：PP14 S1基因的5’末端与 M41同源率达96％，与Ark99同源率为77%，其下紧接着的402个碱基中，与 M41、Ark99的同源率分别为：69％、94％。另外，PP14的3’非编码区与 Ark99的同源率高达99％。这说明 PP14可能由 M41与 Ark99重组而来。Kuster等[33](199O)通过比较8株IBV S2片段氨基酸同源率，也认为在野外IBV基因组间有重组的可能。这表明同时运用几种不同的IBV弱毒苗时，从长远看来可能是危险的。Cavanagh等研究了Mass血清型的重组[31]。Sapats[15]也报道致病性的H52和致弱株H120之间的差异仅表现在S1基因第126位氨基酸的不同。T1酶指纹图谱分析也表明，一些从暴发IB的鸡群分离出来的野毒株与疫苗株变异而来。Eisenlohr[35]研究认为，RNA病毒的一个氨基酸的差异还可能造成病毒抗原处理过程包括在内质网中递呈抗原给MHC分子和抗原肽棗MHC分子与TCR识别过程的障碍。Ossendorp[36]的试验证实病毒编码的抗原氨基酸从R到K的转变导致蛋白酶消化后的抗原肽不能有效地被转运相关蛋白运输到内质网中，从而抑制了有效的抗病毒免疫反应。IBV抗原的复杂性对其高效疫苗研制带来了巨大的困难。

目前，IB常用的疫苗有两类，即灭活苗和弱毒苗，特别是使用本地区毒株及多价疫苗是防制IB的更为有效的方法。弱毒疫苗仍存在许多自身难以克服的缺陷，如有变异问题、病原散播等方面难于控制。随着分子生物学、遗传学和免疫学的发展，遗传工程技术的应用，使IB基因工程疫苗研究得到了迅速发展。在IB新疫苗研制上，与传统技术进行比较时，需着重考虑以下几点：

1、这种疫苗是否比现有疫苗具有更强的免疫原性；
2、安全性如何；
3、生产和使用是否廉价；
4、使用是否更容易；
5、是否有利于有效地合并使用；
6、是否能克服母源抗体干扰；
7、对于防治一种特殊疾病的安全高效疫苗是否能通过DNA技术生产。

另外，对于鸡IB疫苗株与鸡新城疫（ND）疫苗株联合制苗的问题， Hanson等和Raggi则认为两种疫苗联合应用有干扰作用，主张单独使用[1]。王红宁等较为成功地研制了IB-ND二联油乳剂灭活苗以及IB-IBD-ND三联油乳剂灭活苗等联苗 [42，并证实在灭活苗的研制中，将两（三）种病毒分别灭活后再制成联苗可消除干扰作用。

总之，IBV在自然界宿主更迭的过程中不断发生变异[4]。尽管常规的综合防治措施在一定程度上控制了本病的大规模流行，但免疫鸡群高发病率、高死亡率的现象仍时有发生。究其原因，免疫程序不当、饲养管理不善、疫苗质量欠佳以及多种以呼吸道及肾炎病变为特点的疫病的混合感染固然是不可忽视的因素，但IBV抗原地方性分布差异的特点以及病毒基因组RNA点突变、缺失、插入和不同毒株之间的同源重组等所造成的病毒高度变异是至关重要的原因。同时，还与自然选择、多株免疫、高密度饲养形成的压力筛选及宿主免疫状况有关。传统弱毒苗在使用过程中，有可能与其它IBV毒株发生重组或自身条件下发生变异而出现新毒株或超强毒株，故常出现免疫失败，给本病的诊断和防治带来困难[25]。因此，目前应在多价灭活疫苗推广应用的基础上，进一步研制广谱安全的基因工程疫苗将是解决防制IB的根本途径。

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