最新药敏试验

张月平 · 发表于 2008-12-10 14:45:43

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药物敏感实验

一. 目的：
测定细菌对抗菌药物的敏感性，帮助临床医师选择最合适的抗菌药物
进行治疗，有效的减少药物开支和加快患禽的康复。
二. 要求：
无菌操作，划菌均匀密布，药敏片应选择能购买到的抗菌药物进行实验
三.实验材料：
1.普通营养琼脂培养基
2.药敏试纸（各大医院购买或自制；青岛海慈医院有售）
3.被试细菌
4.接种环
5.酒精等
6.打孔器
四.实验准备：
1.药敏片的制备：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15~20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。
2.抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25
毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3~6个月。
3.药敏片制备方法参考（表—2）
五.实验操作方法
1.划线法
1.1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）
1.2将镊子于酒精灯火燃灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面，。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片）最后，每种药敏片的名称要记住。
1.3将平皿培养基倒置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。
六.结果观察：
浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。
七.影响药敏结果的因素
1.培养基  琼脂平皿内培养基的厚度  。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
2.细菌接种量  细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性
八.判定标准：
1.药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。
2.多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。
3.药物敏感实验判定标准参考表—1
九.应用：
药物敏感实验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助应用，以减少耐药株

表—1                药物敏感实验判定标准
抑菌圈直径（毫米）敏感度
      20以上                极敏
      15—20                高敏
      10—14                中敏
      10以下                低敏
      0                         不敏
表—2             药物敏感纸片制备
项目药名    药液配置药液浓度单位/ml
mg/ml 纸片含量  微克/片
      单位/片

青霉素 20毫克+PH6.0缓冲液15.5毫升混匀后吸取1.0毫升加入PH6.0缓冲液9毫升混匀
200
1.0
土霉素 30毫克+0.1NHC14.325毫升+PH3.0缓冲液10毫升 2 10
四环素 30毫克+0.1NHC14.67毫升+PH3.0缓冲液10毫升 2 10
红霉素 40毫克+水13毫升 2 10
痢特灵 10毫克+纯冰酮10毫升 1 5
庆大霉素 20毫克+水10毫升 2 10
青霉素G 20毫克+水10毫升 2 10
妥布霉素 20毫克+水10毫升 2 10
磺胺嘧啶 200毫克（1毫升）+水9毫升 20 100
金霉素 30毫克+PH3.0缓冲液12.9毫升 2 10
多粘霉素 20毫克+水10毫升 2 10
新霉素 20毫克+PH6.0缓冲液10毫升 2 10
氯霉素 20毫克+水10毫升 2 10
卡那霉素 20毫克+水10毫升 2 10
链霉素 40毫克+PH7.8缓冲液13.1毫升 2 10
杆菌肽 20毫克+PH6.0缓冲液10毫升
注：试剂的制备：
（1）PH6.0磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钾2克、磷酸二氢钾8克、蒸馏水1000毫升
（2）PH7.8磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钾0.523克、磷酸二氢钾16.73克、蒸馏水1000毫升
（3）PH3.0枸橼酸缓冲液：枸橼酸7克、磷酸氢二钠3克、蒸馏水1000毫升
以上缓冲液加热溶解后，用PH试纸或PH计测定酸碱度，高压蒸汽灭菌。
（4）18.3%盐酸溶液：在500毫升蒸馏水中，徐徐加入（36%HCI）420毫升，然后用蒸馏水加至1000毫升。若配置0.37%盐酸溶液用蒸馏水稀倍。
菌落在