血凝实验与抗体检测简介

神九研究所 · 发表于 2008-12-7 11:40:13

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            应广大养殖朋友和一些兽医朋友的要求，今将养殖场中常做的血凝试验（HA）和测血液或卵黄中禽流感和新城疫等抗体的血凝抑制试验写出来，以供朋友参考，不当之处，尚请斧正。

         石家庄神九研究所          石家庄正大饲料公司

            刘会芳                      王慧萍



血凝试验

一、血凝原理：正粘病毒（流感）和副粘病毒（新城疫）EDS病毒等有血凝素，能够使家禽的血细胞凝集。冠状病毒得经胰蛋白酶处理才能较好地凝集。

二、抗体监测原理：血凝抑制（ＨＩ）试验。抗体监测。利用抗体来中和病毒使血凝能力不断下降。

三、凝和不凝的判断。病毒与家禽的（有核）红细胞结合后产生凝集，红细胞带上电荷相互排斥而在一定时间内（大于半小时）不沉淀。一般的细胞则在重力的作用下沉淀下去，是为不凝集。（最后都沉）

四、血凝的判断：以完全不沉为凝集。半沉半凝集不算。（即沉的是不凝，不沉的是凝）

五、血凝试验的作用：1、判断有无病毒。（4㏒2为一标准）2、疫苗的凝集价。

六、对血细胞要求：SPF鸡血最好，健康未免疫鸡次之，免疫健康鸡最差（大量用），病鸡坚决不用。大量使用的免疫健康鸡血应多洗几遍。

七、采血方法：心脏采血1、垂直采血2、水平采血（鸡采不死）

八、采血洗血步骤：

1、取无菌10ml注射器加入几粒到十几粒枸橼酸钠（防凝血），抽取5、6ml生理盐水

2、垂直或水平采血，针头能碰到跳动的心脏后再向前进几毫米，出现回血，轻抽注射器即可

3、将血放入离心管，放入离心机中，加另一全是水的起平衡作用的离心管，使离心机从0逐渐加到1500～2000转，10 ～15分钟，停机，取出离心管，用吸管吸取上清液及一层薄薄的白细胞再加生理盐水并利用吸管的水流将红细胞搅匀，再离心，多次离心，（将细胞可能因免疫所致的影响降低。最后将红细胞配成0.5 ～1%备用。

九、血凝测定步骤：

在96（8×12）孔微量板上以1~2排（8~2×8个）为单位，用8道（芬兰产1800~2400元每个）或单道微量移液器每孔加25微升生理盐水，在每组的第一孔加25微升待测液体，然后向后倍比稀释，弃去最后一滴于盛废液的容器中。再每孔中加入配好的红细胞液25微升，在振荡器上作用2分钟。放入37℃恒温箱中。大约在25~30分钟时看一下结果。（流感比新城疫时间略早5分钟）注意设对照。（注意移液的使用，一是可调的二是大拇指压的两个刻度２５混合８次　５０加液要压到底）(更换吸头)

十、结果判定：以彻底不沉为凝集，数数即可。利用此结果进行稀释标准抗原至4个病毒单位（注意体积换算）例1ml2的10方抗原就需加生理盐水256ml。以备抗体监测之用。抗体监测与血凝试验刚好是反着的。监测鸡群的抗体水平是适用和需要的。

十一、采血制血清：

1、翅静脉、皮肤上的口要与静脉上的口要一致，否则出血包。（与兔耳静脉不一样）

2、输液管7cm、接血自流，然后封口，血清自出（需要时挤一下），也可用离心机低速离心一下。

十二、抗体监测步骤：

1、在96孔板上每孔加入25微升生理盐水

2、加入4单位的标准抗原或相近品

3、在第一孔加入待测血清或卵黄液，倍比稀释弃去最后一滴

4、各加入一滴配好的红细胞液

5、振荡2分钟放入37℃恒温箱中

6、25~30分看结果，从左始，以完全沉淀为准计数，即2的几次方。另外有的专家将3和2对调，结果一样。同时要做对照。

抗体监测

十三、数据分析：2 的8次方为一个标准，小鸡可5或6，但大鸡不行，就是该做苗了。如果数相差大，如2的3次方与2的11次方同在，就有可能是野毒感染了。有的抗体为０，就是苗没有发挥作用、鸡不行或苗有问题的。

十四、抗体监测一是准确，提升自己水平，提升门市档次；二种鸡场大量应用。

十五、另外还有酶联反应、PCR技术（确诊人AI）成本太高，不适合推广。目前实用的是胶体金试纸。价廉且操作方便对人和场所要求低。