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发表于 2008-10-2 19:32:45
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来自： 中国辽宁辽阳
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植物血凝素
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2007-2-28 22:07 作者: 魁罡 来源: 畜牧人
植物血凝素Phytohaemagglutinin
植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。由于其较难提纯，且成本极高，所以一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂。
植物血凝素在动物疾病防止上的应用，主要进行以下实验：
1．利用鸡的白细胞脾细胞鸡胚成纤维细胞以有机锗（Ce—123）新城疫弱毒株（NDV-F）植物血凝素（PHA）聚肌胞（POLYI:C）为诱生剂，对外源性干扰素（IFN）诱生条件如诱生剂量诱生时间及培养条件进行了比较分析和探讨，结果发现以Ce—123诱生IFN的能力为最强，其他依次为：PHA NDV-F POLYI:C；且鸡脾细胞和鸡白细胞产生的IFN效价高于鸡胚成纤维细胞；并且最佳诱生剂量依次为：Ce—123为70微克/毫升；鸡NDV-F为128HAU/毫升；POLYI:C为60微克/毫升；PHA为20毫克/毫升。该研究表明，植物血凝素在机体内刺激机体产生干扰素的能力是聚肌胞的30倍，所产生的作用是是直接服用干扰素的300倍，所以服用1mg植物血凝素相当于服用30mg的聚肌胞和直接服用300mg干扰素。
2．PHA对家禽的新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、脑脊髓炎、流感等疾病的预防及治疗效果。结果表明PHA对下列病毒感染的保护率分别为新城疫77。5%、传染性法氏囊病92。5%、传染性支气管炎85%、传染性喉气管炎77。5%、脑脊髓炎90%、流感80%。
PHA的作用机理
1．PHA刺激T细胞增殖分化产生大量效应T细胞和细胞毒T细胞；效应T细胞分泌产生大量细胞因子（如干扰素等）杀伤病毒；细胞毒T细胞可直接杀伤病毒。
2..PHA同时可刺激B细胞转化为浆母细胞然后增殖分化为浆细胞，浆细胞产生大量的非特异性抗体来中和病毒。
植物血凝素对鸡常见病毒病的疗效研究
为了验证植物血凝素对鸡新城疫、传染性法氏囊病、鸡肾型传支等6种病毒病的预防效果，指导临床合理用药，特进行了本实验。
1．材料和方法
1．1药物 植物血凝素，由生化试剂公司提供。
1．2实验动物及分组 1日龄肉鸡520只，购自南京迈本桥鸡厂，用温控育雏笼正常饲养，从21日龄开始给药，至28日龄用于实验。随即分组3组，每组40只，处理祥见表一
表一 实验鸡感染与用药
组别
鸡只数
用药
用法
1
40
阳性对照组
不用药，不感染
2
40
阳性对照组
不用药，28日龄感染
3
40
PHA组
饮水，连用7日，28日龄感染
1．3攻毒用毒株NDV强毒，IBDV强毒，肾型IBV强毒，ILTV强毒,AEV强毒，HAV强毒，南京农业大学动物医学院预防医学系传染病组馈赠。
1.4人工发病 参考常维山等方法，即种毒经37℃水浴融化，用灭菌生理盐水加双抗20倍稀释后，4℃冰箱作用30分钟，按每胚0。2ml接种10日龄鸡胚，37℃孵育，弃取24h内死亡鸡胚，接毒后36h将鸡胚放入4℃冰箱过夜，无菌收集尿囊液。除健康对照组外，其余各组进行人工感染各种毒株强毒，感染剂量1ml含毒尿囊液，滴鼻或点眼0。5ml，肌肉注射0。5ml。同时鸡舍断电降低舍温，适当减少饮水供给以诱使发病。
1．5预防实验 28天后按表一进行感染，实验期14天，每天定时观察各组鸡的采食、饮水、精神状况、临床症状，记录死亡情况，并对病死鸡进行尸体剖检。
1．6疗效评价指标
1．6．1 死亡率：具有各种传染病的各种典型症状及病变的死亡鸡占该实验组鸡的百分比。
1．6．2治愈率：经用药治疗后，存活病鸡临床症状完全消失的占该实验组的百分比。
1．6．3数据统计处理：用常规统计学方法（X2检验）对各组死亡率，治愈率进行显著性检验。
2.结果
实验期各用药组存活鸡的临床症状逐渐减轻消失，精神、采食、饮水逐渐恢复正常；用药组死亡率明显低于感染对照组，剖检可见同一时间死亡的病鸡比感染对照组病变轻。各组死亡率、治愈率，见表二。
表二PHA的预防结果
组别
用药
死亡率（%）
治愈率（%）
实验结束时有症状鸡数（只）
1
阳性对照组
0
—
—
NDV组
攻毒
阳性对照组
42．5（17/40）
17．5
16
PHA组
15（6/40）
77．5
3
IBDV组
攻毒
阳性对照组
32．5（13/40）
27．5
16
PHA组
5（2/40）
92．5
1
攻毒
IBV组
阳性对照组
35（14/40）
22．5
17
PHA组
7．5（3/40）
85
3
攻毒
ILTV组
阳性对照组
30（12/40）
25
18
PHA组
15（6/40）
72．5
5
攻毒
AEV组
阳性对照组
20（8/40）
22．5
23
PHA组
7．5（3/40）
90
1
攻毒
HAV组
阳性对照组
47．5（19/40）
15
15
PHA组
17．5（7/40）
80
1
3．结论与讨论
PHA主要通过诱导干扰素产生，提高机体免疫力，达到预防疾病的效果。从本实验结果看出，PHA对家禽鸡新城疫、传染性法氏囊病、传染性传支气管炎、传染性喉气管炎、脑脊髓炎、流感等疾病的预防效果明显，治愈率分别为鸡新城疫77．5%、传染性法氏囊病92．5%、传染性传支气管炎85%、传染性喉气管炎72．5%、脑脊髓炎90%、流感80%。
四种诱生剂诱生干扰素实验
为了比较有机锗（Ce—123）新城疫弱毒株（NDV-F）植物血凝素（PHA）聚肌胞（POLYI:C）四种诱生剂对鸡白细胞、脾细胞、鸡胚成纤维细胞的诱生干扰素作用，本实验进行了此四种诱生剂的体外诱生干扰素的能力研究，为临床使用提供一定的依据。
1．材料与方法
1．1材料
新城疫弱毒株（NDV-F），水泡性口炎病毒（VSV），长春凯旋制药厂提供。鸡白细胞、脾细胞、鸡胚成纤维细胞均由南京农业大学动物医学院微生物教研室提供。有机锗（Ce—123）植物血凝素（PHA）聚肌胞（POLYI:C）由生化试剂公司提供。细胞培养基DMEM，干粉培养基均为美国CibcoBRL公司产品，小牛血清为杭州四季清生物公司产品。
1.2方法
1．2．1鸡白细胞、脾细胞、鸡胚成纤维细胞干扰素的诱导。参照Carter等人和郑茂林报道方法，设立4个比较试验。
1.2.1.1诱生时间的研究
在制好的鸡胚成纤维细胞悬液中，加入Ce—123（70ug/ml），NDV-F（128HAU/ml），PHA（20ug/ml），POLYI:C（60ug/ml）37℃静置培养，分别在培养12、18、24、30、36h收获细胞培养的上清液，每个时间组3瓶，测定IFN效价后取平均值。
1.2.1.2培养温度对诱生作用的影响
在制好的鸡胚成纤维细胞悬液中，加入Ce—123（70ug/ml），NDV-F（128HAU/ml），PHA（20ug/ml），POLYI:C（60ug/ml），分别在30℃和37℃静置培养，培养24h收获细胞培养的上清液，每个温度组3瓶，测定IFN效价后取平均值。
1．2．1．3诱生剂添加量的比较
有机锗（Ce—123）设4个剂量组：10、40、70、100ug/ml新城疫弱毒株（NDV-F）设4个剂量组：64、128、256、512HAU/ml植物血凝素（PHA）设4个剂量组：10、20、30、40ug/ml聚肌胞（POLYI:C）设4个剂量组：20、40、60、80ug/ml收获上清液，每个剂量组3瓶，测定IFN效价后取平均值。
1.2.1.4不同细胞、不同IFN诱生剂在静置培养条件下产生IFN的比较研究。
以鸡白细胞、脾细胞、鸡胚成纤维细胞作为生产IFN的细胞，分别加入Ce—123（70ug/ml），NDV-F（128HAU/ml），PHA（20ug/ml），POLYI:C（60ug/ml）作干扰素诱生剂，37℃静置培养24h。
1．2．2诱生干扰素效价测定实验。
采用细胞病变抑制法测定IFN效价。以VSV作为被干扰病毒，用鸡胚成纤维细胞作为检测系统，能抑制50%细胞病变的最高稀释度为一个干扰素活性单位。以
Log2CPEI50/ml或国际单位/毫升（U/ml）.
2.结果
2．1诱生时间的研究结果
四种诱生剂培养不同时间诱生IFN的结果见表三。
由表三可以看出：Ce—123，NDV-F和PHA的诱生IFN峰值在24h，而POLYI:C的峰值在18h，因此Ce—123，NDV-F和PHA的诱生IFN的收获时间以24h为宜，而POLYI:C的收获时间以18h最佳。
表三四种诱生剂培养不同时间诱生IFN效价（log2U/ml）
时间（h）
Ce—123
NDV-F
PHA
POLYI:C
12
6.0132±0.1054
3.9868±0.1126
4.1245±0.1137
3.7546±0.0314
18
7.3541±0.0946
5.7842±0.0613
6.1547±0.0971
7.8134±0.0134
24
9.7931±0.1542
8.1453±0.1431
8.6457±0.1671
7.2314±0.1148
30
8.1354±0.1125
7.0014±0.1247
7.3145±0.0856
5.4217±0.0841
36
6.2147±0.0786
2.8734±0.0941
2.9863±0.0538
2.5467±0.0452
2.2培养温度对诱生作用的结果
两种不同培养温度对对诱生作用的影响结果见表四。
由表四可以看出，37℃时四种诱生剂的诱生能力好于30℃的诱生能力，因此本实验选用37℃作为四种诱生剂的培养温度。
2．3诱生剂最佳诱生剂量的研究
诱生剂最佳诱生剂量的结果见表五。
又表五可以看出，Ce—123随着添加量的增加，其诱生能力增强，中等剂量与高剂量相比，略低，比低剂量和最低剂量高，差异显著；NDV-F和PHA在低剂量时诱生效果最好，高剂量反而下降；POLYI:C在中等剂量诱生效果最佳。因此，Ce—132 NDV-F PHA 和POLYI:C的最佳诱生剂量分别为70ug/ml,128HAU/ml,20ug/ml,60ug/ml.
表四 四种诱生剂不同培养温度诱生IFN效价（log2U/ml）
30℃
37℃
Ce—132
9．0273±0。1342
9．5381±0。0457
NDV-F
7．9214±0。1496
8．2436±0。1671
PHA
8．1249±0。1054
8．7136±0。1148
POLYI:C
7．0104±0。1215
7．3725±0。1431
表五 四种诱生剂不同剂量诱生IFN效价（log2U/ml）
Ce—132
NDV-F
PHA
POLYI:C
高剂量
10．0153±0。0954
4．5868±0。0612
4．1245±0。1137
6．8135±0。0134
中剂量
9．8324±0。1425
6．0134±0。1306
6．7154±0。1097
7．9542±0。1413
低剂量
7．3541±0。0946
8．3217±0。0431
8．8575±0。1134
7．0137±0。1084
最低剂量
4．2514±0。1341
5．7834±0。1004
5．3145±0。0931
5．7189±0。0913
2．4不同细胞、不同IFN诱生剂在静置培养条件下生产IFN的比较研究
不同细胞、不同IFN诱生剂在静置培养条件下生产IFN的比较结果见表六。
由表六可以看出，以Ce—132为诱生IFN的能力最强，其次是PHA，POLYI:C的效果最差。此四种诱生剂，经统计学分析，诱生能力差异显著（P<0）。三种细胞产生IFN的滴度差异显著（P<0），脾细胞与白细胞相当，差异不显著（P>0），比鸡胚成纤维细胞效果好，差异显著（P<0）。
表六不同细胞、不同IFN诱生剂在静置培养条件下生产IFN的效价（log2U/ml）
Ce—132
NDV-F
PHA
POLYI:C
白细胞
9．7312±0。1405
8．1937±0。0978
8．9868±0。1062
7．0135±0。1034
脾细胞
9．5841±0。0964
8．1531±0。1063
8．9004±0。1214
6．9542±0。1013
鸡胚成纤维细
8．7931±0。1254
7．3014±0。1431
8．0457±0。1071
4．0137±0。1084
3．小结
由上述结果可以看出，Ce—132诱生IFN的能力最强，其他依次是PHA，NDV-F，POLYI:C，且鸡脾细胞和鸡白细胞产生的IFN的效价高于鸡胚成纤维细胞。Ce—132 NDV-F PHA 和POLYI:C的最佳诱生剂量分别为70ug/ml,128HAU/ml,20ug/ml,60ug/ml.。
通过PHA 和POLYI:C的比较可以看出，植物血凝素在机体内刺激机体产生干扰素的能力约为聚肌胞的30倍，所产生的作用是直接服用干扰素的300倍，所以服用1mg植物血凝素相当于服用30mg的聚肌胞和直接服用300mg干扰素。 |
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发表于 2008-10-1 19:50:30
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