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发表于 2008-8-19 16:43:45
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来自： 中国河南郑州
喹诺酮类化合物是一组广谱抗微生物药，主要作用于革兰氏阴性菌和支原体。其亚群氟喹诺酮比喹诺酮的抗菌性能更强、更广谱（包括革兰氏阳性菌）。目前批准上市的喹诺酮和氟喹诺酮类药物包括：环丙沙星（CIP）、二氟沙星（DIF）、恩诺沙星（ENR）、氟甲喹（FLU）、哈喹诺（HAL）、萘啶酮酸（NAL）、诺氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFL）、噁喹酸（OXO）、吡咯嘧啶酸（PIF）沙拉沙星（SAR），达诺沙星（DNA）等。喹诺酮类药物的作用机理还不十分清楚，一般认为喹诺酮可以抑制细菌DNA旋转酶的活性，影响DNA形成双螺旋结构。 造成细菌染色体不可逆的损伤，使其细胞不再分裂，从而杀灭细菌。喹诺酮类药物早在80年代初开始用于水产养殖，后来又用于家禽和养猪生产上。1995年FDA已批准，盐酸沙拉沙星可通过饮水给药用于预防、治疗鸭和禽的大肠杆菌病；1996年批准恩诺沙星可通过饮水用于控制禽和鸭的大肠杆菌病相关的死亡。我国于90年代初最先批准诺氟沙星用于畜禽养殖生产，以后批准氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、培氟沙星、沙拉沙星、达诺沙星等用于畜牧生产。在预防疾病方面，喹诺酮和氟喹诺酮类药物的主要用来预防细菌性疾病，如奥索利酸、氟甲喹和恩诺沙星及其的主要代谢物环丙沙星；喹诺酮也作为饲料添加剂来预防疾病。在治疗疾病方面，喹诺酮对家禽的巴氏杆菌病、大肠杆菌病；小鸡、鸭、牛犊和生猪的霍乱等疗效显著。主要的给药途径是通过高剂量的加药饲料或饮水。
1 喹诺酮药物的代谢与残留
喹诺酮类药物通过口服对单胃动物的生物利用率很高，食物组成的改变可能延缓该类药物有吸收，但不改变药物的吸收程度。然而喹诺酮对反刍成畜的生物利用度很低。喹诺酮类药物可迅速从血液扩散到组织中，在细胞内的浓度很高，对于治疗细胞内感染十分有益。如环丙沙星对支原体有很强的抑制和杀灭作用，被用来治疗由支原体引起的各种疾病。由于这个原因和它们的广谱抗菌性而被广泛使用。
喹诺酮类药物主要是通过肾脏消除，它可以较高的浓度随尿排出。它们和血浆蛋白的结合力较低，但有很高的脂溶性，并在骨骼和皮肤中蓄积。在肝脏中的生物转化包括初级代谢物、偶合的葡萄糖醛酸化合物(无活性)、脱烷基化和氧化物(1)。许多喹诺酮类药物对动物及人类的毒性影响已经被证实，特别是萘啶酮酸已经被证实有干扰繁殖系统，影响光敏感性、致癌和致突变作用等(2)。在欧州，仅有恩诺沙星和环丙沙星的最高残留限量被建立，鱼、家禽、猪肉的肌肉和肝脏中为30ppb，在瑞士，奥索利酸和恩诺沙星在奶、蛋、牛肉的最高残留限量为10ppb，在美国，所有喹诺酮类药物没有建立任何安全浓度(SC)。我国至今也没有制订喹诺酮类药物的最高残留限量。
2．残留量分析
公开发表的测定组织中喹诺酮和它的活性代谢物残留量的方法包括：筛选方法---微生物抑制试验(MIA)和免疫测定法，定量方法---薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱/质谱测定法，一般实验室最常用的方法是高效液相色谱法。
2．1 筛选方法
通常的筛选方法不需要复杂的提取过程和样品制备过程。例如将涂有液体样品的纸片放于一个已接种特定菌株的琼脂平楹上。同样，未经提取的组织样品可直接置于琼脂平楹上。对于荧光分光光度法，则需要复杂的样品处理过程。
2．1．1 微生物抑制分析法(MIA)
检测抗微生物药物MIA技术用来检测喹诺酮类药物已有报导，通常的操作方法是将组织切片和抗微生物药均匀分散到琼脂培养皿中抑制微生物的生长。喹诺酮药物使用敏感的大肠杆菌菌株作用于特异性的生物体。挪威已经制定了MIA作为鱼类药物残留筛选的官方分析程序，操作程序是：将经处理的鱼肝切片置于接种有大肠杆菌ATCC(11303)菌株的营养琼脂培养皿中，过夜，测量抑菌圈的面积，对所有阳性者或可疑者用高效液相色谱法进行确证(3)。据报导，这种方法对肌肉样品的检测水平可达50ppb。其他喹诺酮药物MIA检测方法也有报导。MIA方法的灵敏度与分析者所期望的水平和规定的最高残留限量(MRLs)显示出满意的结果，尽管如此，在所期望的检测水平下阴性样品的可靠性不被保证。例使用大肠杆菌(ATCC11775株)和水提取的组织，对奥索利酸、氟甲喹和萘啶酮酸的检测灵敏度仅达250-300ppb水平。
表1微生物抑制方法
喹诺酮类组织或提取物菌株 最低检测限(LOD)
沙拉沙星血浆、骨骼 B.subtillis200ppb
其他组织 E.coli-14 250-2000ppb
其他鱼肝 E.coli(11303)50-250ppb
OXO，NAL，FLU鱼提取物E.Coli(11775)250-500ppb
2．1．2 荧光分光光度法
Waggoner和Bowman用荧光分光光度法对雏鸡和鸭组织中恩诺沙星残留进行了检测，这种方法用二氯甲烷和甲醇进行提取，且提取次数多、时间长，在激发波长350nm和发射波长450nm条件下，检测水平是10-50ppb。
2．1．3免疫化学测定法
免疫分析方法广泛地应用于临床诊断领域，最近被引用于可食组织中的药物残留检测。这种方法使用特定的抗体识别目标药物，目标药物和标记药物互相竞争性地与特异性抗体进行结合，形成药物-抗体复合物，通过复合物和酶结合显示的颜色或底物的颜色来进行分析。有报导，抗体竞争免疫用于检测乳中环丙沙星的残留量，检测水平达5-10ppb。
2．2 定量分析方法
喹诺酮类残留检测最常用的方法是高效液相色谱的荧光检测分析法，也有使用薄层色谱和气质联用的报道。检测水平在100ppb左右，个别达到10ppb水平。
2．2．1 提取
从组织中提取被测物质大致可分为3种主要的类型。一是在pH中性条件下用有机溶剂提取。例如，5g组织和6.5g硫酸钠及15ml乙酸乙酯强烈旋混并振摇10min，3000r/min离心5min。对尿、血浆或肉类，乙睛是一种比较理想的提取溶剂，如5g肉和20ml乙睛匀桨，脂类用石油醚除去，然后蒸发去掉乙睛(5)。二是在碱性条件下提取。喹诺酮类都能溶解在强碱中，许多文献推荐采用弱碱性溶液作为储备液(如0.1mol/L氢氧化钠溶液)。例如3g组织和1ml氨水、5.1ml乙睛混合匀桨1 min后,3000r/min离心3min(4)。三是在酸性溶液中提取。例3g组织和87%三氯乙酸(TCA)2ml、甲醇 0.5ml，混合匀桨1 min后，5000r/min离心5min。
2.2.2 纯化和浓缩
经典的液—液提取的回收率超过90%。通常交替利用酸(85%磷酸氯仿溶液)和/或碱性缓冲液(2mol/L的氢氧化钠氯仿溶液)来提纯喹诺酮。喹诺酮能溶解在碱性溶液中，因此在碱性溶液中有较高的回收率。一般情况下，喹诺酮不溶于酸，用有机相回收，也有报导用固相来萃取(SPE)作为纯化或浓缩方法。早期的高效液相色谱分析方法中，氨基SPE柱被用来提纯和浓缩氟甲喹，回收率达75%—80%，喹诺酮最后的提纯也使用C2和C18反相柱来完成。具体操作如下：组织样品中加入内标,和1mol/L NaOH-丙酮(1:10,v/v),匀浆,离心，再用1mol/LNaOH-丙酮(1:10,v/v)重复匀桨两次，离心，水相用己烷提取，蒸发己烷/丙酮残留，再加入磷酸，用己烷提取，废弃己烷，水相C18SPE柱纯化,经水、磷酸冼涤，再用甲醇-磷酸(1M)(9:1，v/v)冼脱，用甲醇-水稀释至10ml，高压液相色谱仪测定。
2.2.3 薄层色谱法
薄层色谱法和液相色谱法相比灵敏度较低(1000ppb或更低)。据报道，硅胶G60F254荧光高效薄层色谱法测定组织中恩诺沙星的检测水平接近1000ppb(6)。因此，TC薄层色谱法对在残留限量100ppb浓度下的微量或痕量分析是没有意义的。
2.2.4 高效液相色谱法(HPLC)
单个喹诺酮残留量的各种HPLC分析方法都有报道。在较低水平下测定喹诺酮残留，荧光检测器是最常用的(表4 )。用反相柱分离有较尖锐的峰和较低的噪音水平或拖尾，分离度良好。这种PLRP-S聚合柱在使用0.02M磷酸-乙睛-四氢呋喃(68：17：15)流动相时对沙拉沙星和恩诺沙星有良好的分离度。磷酸和乙睛比例的微小改变及选择合适的柱子都能获得满意的结果。用pH3的草酸缓冲液替代磷酸和改变甲醇与乙睛组合可获得良好的喹诺酮的分离效果和灵敏度。
表2 各种荧光检测器的检测水平
喹诺酮 组织 检测方法 最低检测限
SAR，ENR 鱼桨/组织 FL：Ex278/Em440 5-10ppb
ENR 奶、肉 FL：Ex278/Em440 3-5ppb
OXO,FLU 鱼组织，鱼silage FL：Ex260/Em380 5-50ppb
FLU 蛋 FL：Ex250/Em370 5ppb
CIP,ENR 鱼、小鸡、猪肉 FL：Ex336/Em375 2-5ppb
FLU,衍生物 鱼、肉桨 FL：Ex327/Em369 5ppb
*检测器：FL-荧光检测器，Ex-激发波长，Em-发射波长
3 展望
喹诺酮类药物的残留分析至今还没有一个是被美国分析家协会(AOAC)认可的官方分析方法或是国际互认的实验室方法。最近一个被同类实验室验证的高效液相色谱方法已经发表(7)。除挪威以外，对喹诺酮还没有一个完整的监测程序。个别政府或公共实验室已经接受不同的方法，但它们主要是高效液相色谱法并作为监测检查的程序方法。高效液相色谱法要作为官方或参考方法仍需作进一步的合作研究和完善。
不好意思，刚看成喹诺酮了 |
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