间接血细胞凝集试验和间接血细胞凝集抑制试验

少林寺

（一）、间接血细胞凝集试验  以下以鸡新城疫为例。
1．仪器设备   微量滴定板：V型、96孔；微型振荡器；微量混合器；塑料采血管；移液器：50μL。
2．试剂  稀释液 pH7.0～7.2磷酸缓冲盐水或生理盐水或。
浓缩抗原：由指定单位提供，也可用含鸡新城疫Ⅲ系弱毒的鸡胚绒毛尿囊液作抗原。
0．5％红细胞悬液： 采健康成年公鸡血，用20倍量磷酸缓冲盐水洗涤3～4次，每次以2000 r／min离心3～4min，最后一次5min，用磷酸缓冲盐水配成0．5％悬液；标准阳性血清 ；
被检血清：每群鸡随机采血20～30份血样，分离血清。 采血法：打用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6～8 cm长。将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000 r／min离心5 min，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中。若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0℃保存。         
3．操作方法
（1）于微量滴定板的每孔中滴加稀释液50μL，共滴四排。
  （2）吸取 1：5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50μL，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取50μL弃之。最后一列不加抗原作对照。
  （3）于每孔中加入0．5％红细胞悬液50μL。
  （4）置微型振荡器上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。
  （5）放室温下(18～20℃)30～40 min。根据血凝图像判定结果。 以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复，以几何均值表示结果。
  （6）计算出含4个血凝单位的抗原浓度。按式(Bl)进行计算： 抗原应稀释倍数=血凝滴度/4。
（二）、 间接血C凝集抑制试验
1．先取稀释液50μL，加入微量血凝板的第 l孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3～12孔，每孔50μL，第2孔加浓度为8个血凝单位的抗原50μL。
    2．吸被检血清50μL于第 l孔(血清对照)中，挤压混匀后吸50μL，于第2孔，依次倍比稀释至第12孔，最后弃去50μL。置室温(18～20℃)下作用20 min。 滴加50μL0．5％红细胞悬液于各孔中，振荡混合后，室温下静置30～40 min，判定结果。
每次测定应设已知滴度的标准阳性血清对照。
3．结果判定
在对照出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度。
    若有10％以上的鸡出现11 ( log2)以上的高血凝抑制滴度，说明鸡群已受新城疫强毒感染。
    若监测鸡群的免疫水平，则血凝抑制滴度在4( log2)的鸡群保护率为50％左右；在4（log2）以上的保护率达90％～100％；在4(1og2)以下的非免疫鸡群保护率约为9％，免疫过的鸡群约为43％。鸡群的血凝抑制滴度以抽样样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示，如平均水平在 4(log2)以上，表示该鸡群为免疫鸡群。