鸡舍微生物监测方案

李建海

一、检测项目、采样种类及数量
采集的环境监测样品需要检测总菌数、大肠杆菌数、葡萄球菌、沙门氏菌和霉菌。一般种鸡场和孵化场每月检测一次，肉鸡场每批检测一次。

采样项目	水样	表面棉拭子	空气	垫料*	终止胚**	弱雏**	绒毛**
采样数量	500ml/舍	6支/舍	5套/舍	50g/舍	30枚	30只/场	50g /出雏器

注：* 代表种鸡场或肉鸡场的采样项目，** 代表孵化场的采样项目，其余采样项目鸡场和孵化场均要采集。
二、鸡舍内环境要求：

常用指标	水样	空气	表面棉拭子	垫料	弱雏、终止胚	绒毛
总菌数	≤10[sup]5[/sup]个/L	≤30个/平皿	≤10个/cm[sup]2[/sup]	≤10[sup]5[/sup]个/g	—	≤10[sup]4[/sup]个/g
大肠杆菌	≤10/L	不得检出	不得检出	≤10[sup]2[/sup]个/g	—	不得检出
沙门氏菌	—	不得检出	不得检出	不得检出	不得检出	不得检出
葡萄球菌	—	不得检出	不得检出	≤10[sup]2[/sup]个/g	不得检出	不得检出
霉菌	—	≤5个/平皿	≤5个/cm[sup]2[/sup]	≤10[sup]2[/sup]个/g	不得检出	400个/g

三、监测方法：
3.1 总菌数
3.1.1  水样
细菌总数是指水样在一定条件下培养后(培养基成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等)所得1mL水样所含菌落的总数。按本方法规定所得结果只包含一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的细菌菌落总数。
培养基与试剂
制法:

营养琼脂

加热溶解，调整pH为7.4～7.6，分装于玻璃容器中(如用国产含杂质较多的琼脂时，应先过滤)，经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
仪器
高压蒸汽灭菌器干热灭菌箱培养箱，36±1℃电炉天平冰箱放大镜或

菌落计数器

pH计或精密

pH

试纸

灭菌试管、平皿(直经9cm)、刻度吸管、采样瓶等。
检验步骤
生活饮用水
以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基内，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36±1 ℃培养箱内培养24h，进行菌落计数，即为水样1mL中的细菌总数。
水源水
以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:10稀释液。
吸取1:10的稀释液1mL注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000，1:10000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1mL灭菌吸管。
用灭菌吸管取2～3个适宜稀释度的水样1mL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。
菌落计数及报告方法
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿一半，而其余一半中菌落数发布又很均匀，则可将此平皿计数后乘2 以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。
不同稀释度的选择及报告方法
首先选择平均菌落数在30～300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之。
若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数；若大于2 则报告其中稀释度较小的菌落总数(如实例3)；若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数。
若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见实例5)。
若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见实例6)。
若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
若所有稀释度的均无菌落生长，则以〈1乘以稀释倍数报告之。
菌落计数的报告: 菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。
3.1.2空气
自然沉降法
设置采样点时，应根据现场的大小，选择有代表性的位置作为空气细菌检测的采样点。通常设置5个采样点，即室内墙角对角线交点为一采样点，该交点与四墙角连线的中点为另外4个采样点。采样高度为1. 2~1.5 m。采样点应远离墙壁lm以上，并避开空调、门窗等空气流通处。
将营养琼脂平板置于采样点处，打开皿盖，暴露5 min，盖上皿盖，翻转平板，置36℃士1℃恒温箱中，培养48 h。
计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数。以每平皿菌落数(cfu/皿)报告结果。

采用平皿空气暴露法测定空气中的细菌数，用直径

90 mm

的培养皿制备培养基，开盖暴露于空气中，暴露

15min

，

37

℃

培养

24 h

计数。

3.2 大肠杆菌
见国标GBT478932-2002
3.3 沙门氏菌
见国标
3.4  葡萄球菌
3.5  霉菌
一、霉菌和酵母菌介绍：
　    霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。
　　霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
　　霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。
二、检验方法：
　　霉菌和酵母的计数方法，与菌落总数的测定方法基本相似。主要步骤为：
　　将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。
　　对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。
　　具体检测标准参见：
　　GB4789.15-94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》
三、说明：
　　1．样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。
　　2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。
　　3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基。
　　马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时，必项加入抗菌素以抑制细菌。
　　孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。
　　高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。
　　4．倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下生长良好，因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。
　　5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。固体检样以g为单位报告，液体检样以mL 单位报告。关于稀释倍数的选择可参考细菌菌落总数测定。
　　6．霉菌直接镜检计数法：对霉菌计数，可以采用直接镜检的方法进行计数。
　　在显微镜下，霉菌菌丝具有如下特征：
　　平行壁：霉菌菌丝呈管状，多数情况下，整个菌丝的直径是一致的。因此在显微镜下菌丝壁看起来象两条平行的线。这是区别霉菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一。
　　横隔：许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等少数霉菌的菌丝没有横隔。
　　菌丝内呈粒状：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。
　　分枝：如菌丝不太短，则多数呈分枝状，分枝与主干的直径几乎相同，有分枝是鉴定霉功得出可靠的特征之一。
　　菌丝的顶端：常呈钝圆形。
　　无折射现象。
　　凡有以上特征之一的丝状均可判定为霉菌菌丝。
　　观察视野中有无菌丝，凡符合下列情况之一者为阳性视野。
　　一根菌丝长度超过视野直径1/6；
　　一根菌丝长度加上分枝的长度超过视野直径1/6；
　　两根菌丝总长度超过视野直径1/6；
　　三根菌丝总长度超过视野直径1/6；
　　一丛菌丝可视为一个菌丝，所有菌丝（包括分枝）总长度超过视野直径1/6。
　　根据对所有视野的观察结果，计算阳性视野所占比例，并以阳性视野百分数（%）报告结果。计算公式：
　　每件样品阳性视野（%）=（阳性视野数 / 观察视野数）×100

郯城老头

学术论文，专业性强，感谢分享。