菌种的保存

少林寺

为了有效的保存菌种，必须掌握每种细菌的生长发育规律及生物学特性，外界物理因素对代谢、生长的影响，定期检查，定期移种，详细记录，专人保管。保存菌种的基本原理是：降低代谢速度以延长其生命。因此，主要采取降低细菌生活环境的温度，使其处于不繁殖，但不致于死亡，仍维持生命的状态；隔绝空气降低代谢过程；冰干脱水，停止生命活动保持生命力。
一、短期保存方法
1．继代培养
传统的菌株保存方法是每隔一段时间便将菌种植入新鲜的培养基中重新活化，间隔时间的长短依微生物、培养基种类及外在环境的不同而有所差异，有些菌种必须每天重新接种做继代培养，有些菌种则数周或数月再重新接种一次便足够。以此种方式保存菌株时，必须考虑三个条件：(1)适合保存的培养基；(2)理想的保存温度；(3)重新接种活化的频率。
常用的保存培养基仅含有最基本的养分，因为微生物在这种培养基中的代谢速度缓慢，可延长重新接种的间隔时间；但是有些菌种因为需要特殊的化合物才能表现出特定的生理现象，所以必须接种于复合性培养基中，若该菌种生长较迅速或有代谢产物累积的情形，则应增加重新接种的次数。
最简单的保存方法是于室温下以试管保存，通常这些试管是放在试管架上或是具有试管座的特制盒中，然而以此种方法保存菌种常有因水分散失而造成菌脱水的问题，除非实验室中有空调设备，可以维持温度的稳定。若使用具有橡胶垫片的螺旋盖，并以蜡纸于螺旋盖处封口，放入塑料盒中，储存于5 --8℃ ，则可防止水分的散失及降低微生物代谢的速率，如此约可维持三至五个月也不必重新接种。重新接种的间隔时间通常须经实验来决定，而保存时应至少有两重复以防遗失，每一次重新接种时亦须检查菌体是否遭受污染和特性表现有无缺失，以确保菌种的品质。接种时避免挑取单一菌落，以防挑到突变株。
此种保存方法主要的缺点是：(1)菌株易遭受污染；(2)菌株易有编号错误、保存位置与编号不符或卷标贴错，以致菌株遗失的情形；(3)可能挑取到突变菌株；(4)不易取得保存的空间。
2．矿物油浸泡保存
利用无菌的矿物油保存菌种是既简单又便宜的方法，且其保存期限可长达数月或数年，但使用这个方法时，常因矿物油灭菌不完全而使菌种遭受污染。最好的矿物油灭菌方法是以烤箱在170℃下加热1 --2 h ，而非以灭菌锅灭菌。以矿物油保存菌种的步骤为先以斜面、平板或液态培养基培养菌株，待菌株长到适当生长期后，加入已灭菌的矿物油，然后保存于 4℃，矿物油的液面必须盖过培养基顶端约 2 cm (若是斜面培养基，则必须全部覆盖) ，其目的为防止水分散失，并降低菌株生长及代谢的速率。每隔一段时间以接种针挑取矿物油下方的菌株重新接种至新鲜的培养基中，接种的过程须注意不要污染菌株，矿物油可直接加于新菌株的上方来保存；而原来旧有保存的活体须至少保存几个星期，以防止新做出的继代培养遭受污染、遗失或丧失某些特性时，还有机会补救。此种菌种保存方式最大的缺点是添加矿物油的过程极为费时费力。
3．一般冷冻保存
菌种可贮存在 -20 --0℃ 之间，菌的存活率则依菌的种类而定，一般而言，应尽量避免使用这种方式，因为冷冻会对菌种造成伤害，然而有些菌可以用此种方法保存 6 个月至 2 年。
二、长期保存方法
1．超低温冷冻保存   此种方法主要将菌种保存于超低温的冷冻柜中，其程序如下：
（1）准备工作
将甘油及蒸馏水以 1:4 的比例混合，配制成 100mL 或少于 100mL 的甘油溶液，于灭菌锅中以 120℃, 20 min灭菌备用。取小量的甘油溶液，分装于保存菌种用的小瓶子中，勿大量装在一起，否则反复冷冻、解冻及接种的过程，均会增加污染或菌株死亡的机会，每次以小量分装，且准备多重复，可以减少前述的缺点。
（2）培养及分装过程
以准备好的的甘油溶液制备孢子、菌丝或细胞的悬浮液后，分装于容积为 2mL 的小塑料瓶中，每瓶各加入1mL的悬浮液，若须盛装较大体积的悬浮液时，亦可选择较大的容器；分装后贮存于 -50℃ 的冷冻柜中，如果菌株已先生长于固体培养基上，也可以将其浸泡于 20% (v/v) 的甘油溶液中，再贮存于冷冻柜。
（3）贮存
将各个小瓶子做好登记及编号，依序置于具有区隔装置的贮存盒中，贮存盒外亦须登记及注明盒内贮存瓶的编号，以便日后能迅速查询；贮存盒的材质可为塑料或腊质包膜等具有防水功能 (如：Nalgene) 之冷冻盒。
（4）重新活化
自冷冻库中取出菌种贮存瓶，置于室温使其解冻，或是以37℃ 水浴迅速解冻，解冻完成后立即取出瓶子，以 70% 酒精擦拭消毒，再以无菌操作方式打开瓶盖，取出菌液接种至新鲜的培养液中重新活化。
2．冷冻干燥保存法
此方法是将冷冻菌种于减压下利用升华去除水份，使菌种保存于无氧、湿气、光的条件下，有些菌种可保存长达30年之久。其操作方法为使用约10毫升的小瓶子，配制20﹪脱脂奶粉或24﹪蔗糖溶液作为保护剂，加上等量的生长培养基，收集菌数浓度约108cells/mL之对数生长期末期或静止期前期之菌体，将菌体悬浮于保护剂及生长培养基中，细菌悬浮液预冷于丙酮或干冰中，使其于减压前冷冻成固体，再将真空度降低至30um 汞柱，抽干18h，熔封后贮存于5℃冰箱即可。