禽沙门氏菌病诊断

少林寺

鸡沙门氏菌病是由某些特定的血清型引起的一类传染病的统称。主要发生于1月龄内的雏鸡。鸡的沙门氏菌病包括三种：鸡白痢、禽伤寒、禽副伤寒。死亡率10—80％，在严重感染时，更高，成年鸡感染沙门氏菌病，虽然死亡率不高，但是，可成为鸡白痢沙门氏菌的携带带者，散布病原、污染环境、经蛋传播，造成代代相传。
（一）、病料采集
无菌采取病死禽的肝、脾、肺、心血、胚胎、未吸收的卵黄、脑组织及其他有病变的组织；成年鸡取卵巢、输卵管及睾丸等组织作为病料。
（二）、检验程序
1．染色镜检  用病料直接涂片，经革兰氏或瑞氏或姬姆萨染色后，镜检，可见革兰氏阴性，单个存在，两端钝圆，无荚膜、不形成芽孢，有鞭毛，具有活泼的运动性的小杆菌。同时利用悬滴法或压滴法进行运动性检查。
2．分离培养  取病料直接接种于普通肉汤、营养琼脂平板、SS琼脂平板或麦康凯平板、鲜血琼脂培养基、三糖铁琼脂斜面培养基上，37度培养18—24h，观察结果。可见在肉汤中呈均匀混浊生长，管底有少量沉淀物；在琼脂培养基上呈圆形、微隆起、光滑、湿润、半透明或灰白色、边缘整齐的露滴状小菌落；在麦康凯平板上呈无色透明的小菌落；SS琼脂平板上呈中心黑色，边缘灰白的透明小菌落；在血琼脂上不溶血，菌落呈灰白色；在三糖铁琼脂斜面上为红色底部呈黄色，产生硫化氢为黑色。
增菌培养：如所取病料中含菌量较少，可以先在四硫磺酸钠肉汤或胆汁肉汤中增菌培养然后再接种选择培养基。
3．生化试验
将在选择培养基上符合沙门氏菌表现的待检菌株，接种于下述生化培养基进行生化特性鉴定。
                   沙门氏菌属生化特性
培养基
菌别
（反应）
葡  半  果  甘  鼠  木 卫  M  V  硫  硝  靛  枸   阿   石   明  色  麦 D
萄  乳  糖  露  李  糖 矛  R  P  化  酸  基  橼   拉   蕊   胶  素  芽 酒酸
糖  糖      醇  糖     醇        氢  盐  质  酸盐 伯糖 牛乳         糖 石盐

白痢沙门氏菌  +   +    +  +   +    + -   +  -  +   +    -   -    +    -    -   -   -   +
伤寒沙门氏菌  +   +    +  +   +    + +             +                       +       +
副伤寒沙门氏菌⊕          ⊕         ⊕  +  -  +   +    -   -    +         -       ⊕

                   沙门氏菌属生化特性
  培养基
菌别
（反应）
糊 侧   甘 肌  菊  乳  棉  蔗  水  山  淀  赖  精  鸟脱 氰  苯酸  赤 尿 棉
精 金   油 醇  糖  糖  子  糖  杨  梨  粉  氨  氨  氨羧 化  丙脱  藓 素 实
   盏醇                糖      苷  醇      酸  酸  酸酶 钾  氨羧  醇    糖

白痢沙门氏菌  -   -    -  -  -    -   -   -   -   -   -            +             -     -
伤寒沙门氏菌                      -       -   -   -                -
副伤寒沙门氏菌    -    - +/-      -       -   -   ⊕      +  +/迟  +   -    -       -

注：+表示阳性；⊕表示产酸产气；+/-表示半数菌株呈阳性；+/迟表示阳性但发酵迟缓；白痢沙门氏菌硫化氢反应慢。
沙门氏菌与亚利那菌在各种选择性琼脂平板上的区别
选择性琼脂平板
          沙门氏菌                          亚利那菌

S.S琼脂
  无色半透明，产硫化氢菌株有的       乳糖迟缓阳性或阴性的菌株其菌落同沙门
菌落中心带黑色                      菌落同沙门氏菌，乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色但中心无黑色形成时与大肠杆菌不能区别

麦康凯琼脂
     无色或浅白色菌落                    无色或浅白色菌落  

煌绿琼脂
  菌落一般呈浅粉白色，有一个红色         同沙门氏菌
晕环，如发酵乳糖和蔗糖为黄绿色

     沙门氏菌与亚利那菌在三糖铁斜面上的区别

菌种
            三糖铁上的表现
      备注


底层
   斜面
   产气
   硫化氢

大部分沙门氏菌
    +         -           +            +
由于产生硫化氢常使试管底
层的酸性反应模糊


鸡沙门氏菌
    +         -           +            ∨

鸡白痢沙门氏菌
    +         -           +           -或弱

鸡副伤寒沙门菌
    +         -           +             +
偶尔发现不产气和硫化氢菌株

亚利那菌

    +         -           +             +
偶尔发现不产气和硫化氢菌株

+            -           -              -

      
4．血清型鉴定  采用玻片凝集法进行。
（1）抗原的准备  一般采用1.5％琼脂斜面培养物作玻片凝集试验用的抗原。
①若O血清不凝集时，将菌种接种在琼脂量较高的（如2.5％--3％）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔置1ml生理盐水中做成浓菌液，在酒精灯火焰上煮沸后再检查。
②若H抗原发育不良时，将菌种接种在0.7％--0.8％半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查或将菌株通过装有0.3％--0.4％半固体琼脂的小玻管（内径3mm，长约5cm）1—2次，自远端取菌培养后再检查。
（2）沙门氏菌属因子血清的准备  可到专门的生物制品研究所购买。
（3）方法  
A.O抗原的鉴定
①用毛细吸管或接种环取沙门氏菌A—F多价O血清1滴，置清洁载玻片一端，另一端放生理盐水，用接种环取少量被检菌培养物或浓菌液制备的抗原，分别放在血清或盐水中，各自充分混匀，轻轻摇动玻片，若前者凝集，后者不凝集，可初步鉴定为沙门氏菌；若细菌培养物制备的抗原在生理盐水中自凝，则为粗糙型菌落，不能用来分型。
②在被检菌培养物与A—F多价O因子血清凝集后，进一步以代表A群（O2）、B群（O4）、C1群（O7）、C2群（O8）、D群（O9）、E群（O11）的因子血清作同样的玻片凝集反应，根据试验结果，判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10，O15，O34，O19单因子血清作凝集试验判定E1E2，E3E4，各亚群。
③菌群判定后，用该群所含的各种O因子血清和被检菌作玻片凝集反应，以鉴定其O抗原。
B．H抗原的鉴定
①属于A—F各O群的常见菌型，依次用下述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。
②检出第1相H抗原而未检出第2相抗原或检出第2相而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1—2代后再检查。如仍检出一个相的抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必作位相变异检查。
位相变异检查方法如下：
a.简易平析法  将0.7％--0.8％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清一环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点接种待检菌株，经培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
b.小玻管法  将半固体管（每管约1—2ml）在酒精灯上溶化并冷至50度，取已知相的H因子血清0.05—0.1ml加入到溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管（内径3mm，长约5cm）内，待凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁边放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩。每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑
制，一般按原血清1：200—1：800的量加入。
每一个抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的凝集结果，没有H单因子血清的，要用两个H复合因子进行核对。
C．Vi抗原的鉴定   用Vi因子血清检查，已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌。
D．菌型确定  在鉴定出O、H和Vi抗原后，查阅库夫曼—怀特沙门氏菌抗原即可确定被检菌的菌型。（见附录）
5.肠杆菌科各属的鉴别
在实际工作中，当从病料或样品中分离沙门氏菌，往往混杂出现其他的细菌，特别是肠杆菌科其他菌属的细菌，由于它们都是革兰氏阴性杆菌，所以有必要对它们进行区别和鉴别。
      表1   在选择性琼脂培养基上肠杆菌科各属的生长表现
     属名
       煌绿琼脂            S—S琼脂             麦康凯琼脂

克雷伯氏杆菌属
肠杆菌属
埃希氏杆菌属         
                                           丰富生长
被抑制              很被抑制            克雷伯氏杆菌和肠
                                     杆菌形成大的粘液样菌落

志贺氏杆菌属
很被抑制，不生长          丰富生长               丰富生长

爱德华氏杆菌属
沙门氏菌
亚利桑那菌属
枸橼酸杆菌属
普罗维登斯菌属
  

丰富生长               中等生长               丰富生长   

变形杆菌属
   中等，不蔓延生长      中等，一般不蔓延生长     丰富，蔓延生长

           
表2  在选择性琼脂培养基上肠杆菌科各属生长的菌落特点
     属名
       煌绿琼脂              S-S琼脂            麦康凯琼脂

克雷伯氏杆菌属
肠杆菌属
埃希氏杆菌属
  
      黄绿色               红色或粉红色           红色

普罗维登斯菌属
志贺氏杆菌属
粉红色有一个红色           浅白色或无色         浅白色或无色
的晕环

爱德华氏菌属
枸橼酸菌属
沙门氏菌属
亚利桑那菌属
一般浅粉白色有一个         浅白色或无色          浅白色或无色
红色晕环，如发酵乳         如产生硫化氢在
糖和蔗糖为黄绿色           48h内形成黑色
                           中心点

变形杆菌属
发酵蔗糖为黄绿色，         浅白色或无色
不发酵蔗糖为浅粉白         有或无黑色中心点        浅白色或无色
色，有红色晕

                表3   在三糖铁琼脂内肠杆菌科各属的反应
   斜面      底层       产气       硫化氢                 可能的细菌

-         +         +/-           +            沙门氏菌属         变形杆菌属
                                               枸橼酸菌属         爱德华氏菌属  

+         +         +/-           +            亚利桑那菌属       变形杆菌属
                                               枸橼酸菌属

-         +          +            -            沙门氏菌属         埃希氏菌属
                                               哈夫尼亚菌属       摩根氏菌属
                                               普罗维登斯菌属

-         +          -            -            伤寒沙门氏菌属     鸡沙门氏菌属
                                               志贺氏菌属         埃希氏菌属
                                               哈夫尼亚菌属       摩根氏菌属
                                               普罗维登斯菌属

+         +         +/-           -            埃希氏菌属          肠杆菌属
                                               克雷伯氏杆菌属      沙雷氏菌属
                                               枸橼酸菌属

                     
表4   肠杆菌科各属生化鉴定
   生化特性
菌属
  硫化氢   运动   吲哚  柠檬   丙二   尿素酶   
（TSL）             酸盐   酸盐           
   脱羧酶
苯丙氨酸脱氢酶

赖氨酸 鸟氨酸

埃希氏菌
（大肠杆菌）
    -      （+）    +     -      -       -        ∨     ∨       -

爱德华氏菌属
    +        +      +     -      -       -        +      +        -

志贺氏菌属
    -        -    （-）   -      -       -        -      ∨       -

沙门氏菌属
    +      （+）    -    ∨      -       -        +      +        -

亚利桑那菌
    +        +      -     +      +       -        +      +        -

枸橼酸菌属
  （+）      +    （-）   +    （+）    ∨        -      +        -

克雷伯氏杆菌属
    -        -    （-）   +      +       +        +      -        -

肠杆菌属
    -      （+）    -   （+）   ∨      ∨      （+）  （+）     （+）

沙雷氏菌属
    -      （+）    -     +    （-）    ∨        +    （+）       -

变形杆菌属
    ∨     （+）    ∨  （+）    -      +         -      ∨        +

普罗维登斯菌属
    -        +      +     +      -      -         -      -         -

6．血清学检验  
A．全血平板凝集试验，适用于成年鸡的鸡伤寒和鸡白痢的诊断，可用于诊断、流行病学调查和无本病健康鸡群监测。
（1）材料准备   鸡伤寒和鸡白痢多价染色平板抗原、强阳性血清(500IU/mL)、弱阳性血清(10IU/mL)、阴性血清；玻璃板、吸管、金属丝环(内径7.5mm～8.0mm)、反应盒或干净玻璃或白色瓷砖、酒精灯、针头、消毒盘和酒精棉等。
（2）操作   在20℃～25℃环境条件下，用定量滴管或吸管吸取抗原，垂直滴于玻璃板上1滴(相当于0.05mL)，然后用针头刺破鸡的翅静脉或冠尖取血0.05mL(相当于内径7.5mm～8.omm金属丝环的两满环血液)，与抗原充分混合均匀，并使其散开至直径为2cm，不断摇动玻璃板，计时判定结果，同时设强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清对照。
（3）结果判定   凝集反应判定标准如下:
100%凝集(#):紫色凝集块大而明显，混合液稍浑浊；
75%凝集(+++):紫色凝集块较明显，但混合液有轻度浑浊；
50%凝集(++):出现明显的紫色凝集颗粒，但混合液较为浑浊；
25%凝集(+):仅出现少量的细小颗粒，而混合液浑浊；
0%凝集(－):无凝集颗粒出现，混合液浑浊。
在2min内，抗原与强阳性血清应呈100%凝集(#)，弱阳性血清应呈50%凝集(++)，阴性血清不凝集(－)，判试验有效。
在2min内，被检全血与抗原出现50%(++)以上凝集者为阳性，不发生凝集则为阴性，介于两者之间为可疑反应，将可疑鸡隔离饲养1个月后，再作检疫，若仍为可疑反应，按阳性反应判定。
B．试管凝集试验  首先用0.5％石炭酸生理盐水将待检血清稀释成1：20、1：40、1：80或更高的稀释度，各取1ml分装试管，然后每试管中加入试管凝集抗原1ml，充分混匀，血清最终稀释度为1：40、1：80、1：160、1：320等。放入37度温箱中作用24h，取出判断结果，凡是1：80出现50％（+ +）以上凝集者为阳性反应。

sj1902

很好，学习了

quicking

太专业了吧，看不太明白，有没有实用点的？简单快捷，像胶体金检测试纸卡那样的