鸡传染性法氏囊病的实验室诊断

斌哥哥

IBD的实验室诊断，取决于病毒的特异性抗体的检测，或组织中病毒的血清学检查，通常不把病原分离和鉴定作为常规诊断的目的。   
    1．琼脂凝胶沉淀试验  本法是检测血清中特异性抗体或法氏囊组织中病毒抗原的最  常用诊断方法。
    (1)病料采集  采集发病早期的血液样品，3周后再采血样，并分离血清。为了检出法氏囊中的抗原，无菌采取10只鸡左右的法氏囊，用组织搅拌器制成匀浆，以3 000r／min离 心10min，取上清液备用。   
    (2)IBD的标准阳性血清和阴性血清。
    (3)琼脂板制备  取1g优质琼脂溶化于含有0.1％石碳酸的8％氯化钠溶液100ml，经  多层纱布脱脂棉过滤，置冰箱备用。有时放在水溶液化并趁热浇在玻片上，每片4mi，厚约  2．5～3mm。也可以吸15ml倒人90mm平皿内。
    (4)打孔和加样  事先制好打孔的图案(中央1个孔和外周6个孔)，放在琼脂板下面，用批孔器打孔，并剔去孔内琼脂。孔径为6mm，孔距为3mm。检测IBDV的抗体时，中央孔和已知的IBDV的抗原，若测法氏囊中的病毒抗原，中央孔加已知标准阳性血清。现以检  测抗原为例进行加样。中央孔加IBD的阳性血清，1、4孔加入已知抗原，2、3、5、6孔加入被检抗原，添加孔满为止，将平皿倒置放在湿盒内，置37℃温箱内经24～48h观察结果。
    (5)结果判定  在标准阳性血清与被检的抗原孔之间，有明显沉淀线者判为阳性，相 反，如果不出现沉淀线者判为阴性。标准阳性血清和已知抗原孔之间一定要出现明显沉淀 线者，本试验方可确认。
    2．免疫荧光抗体检查
   (1)荧光抗体  成都兽医生物药品厂生产
   (2)被检材料  采取病死鸡的法氏囊、盲肠扁桃体、肾和脾，用冰冻切片制片后，用丙酮固定10min。
   (3)染色方法  在切片上滴加IBD的荧光抗体，置湿盒内在37℃感作30min后取出，先用pH7.2PBS液冲洗，继而用蒸馏水冲洗，自然干燥后滴加甘油缓冲液封片(甘油9份，pH7.2PBSl份)镜检。
    (4)结果判定  镜检时见片上有特异性的荧光细胞时判为阳性，不出现荧光或出现非特异性荧光则判为阴性。
    (5)注意事项  滴加标记荧光抗体于已知阳性标本上，应呈现明显的特异荧光。滴加标记荧光抗体于已知阴性标本片上，应不出现特异荧光。本法在感染12h就可在法氏囊和盲肠扁桃体检出。   
    3. 病毒中和试验  可用细胞培养或幼龄鸡进行，他比琼脂凝胶沉淀试验检测抗体更敏感，对估价疫苗的免疫应答是有用的。
    (1)细胞培养中和试验  在微量滴定板的每孔中，加入0.5ml含100TCID50的病毒稀释液。被检血清经56℃灭能30min，然后以滴定板上的病毒稀释液将被检血清作连续倍比稀释。滴定板在室温放30min后，每孔加入0.2ml制备好的鸡胚细胞悬液，置37℃培养4～5天，每天在倒置显微镜观察细胞病变产生的情况，并以不出现细胞病变的最终稀释度的倒数(log2)判定终点。
    (2)用鸡用中和试验  将被检血清在56℃灭能30min。取lml被检血清与lml已知阳性IBD抗原(可用细胞培养毒，lml含200TCID50／0.05ml，或用清亮的10％法氏囊匀浆) 合，置37℃孵良30～60min。将上述混合物滴入7只易感鸡眼内(易感鸡不含有IBD抗    体)，每只鸡滴0.5ml，3天后将鸡宰杀，检查其法氏囊有无病变。同时设立IBD阳性血清和阴性血清作对照。若被检血清采于非免疫鸡群，其阳性血清和被检血清鸡的法氏囊无病变，而阴性血清对照鸡的法氏囊出现病变时，表明被检血清的鸡已感染IBDV；如果被检血清采于免疫鸡群，出现这种情况，说明IBD疫苗免疫应答较好。相反，阳性血清鸡的法氏囊无病变，而阴性血清和被检血清鸡的法氏囊出现病变，表明IBD疫苗免疫应答差。
    3．间接ELISA检测IBDV抗体。
    材料准备：聚苯乙烯微量反应板、酶标测定仪。抗原、兔抗鸡IgG酶标记抗体、阳性血清和阴性血清(自备或购买)。试验溶液配制。
    操作方法： (1)抗原色被  IBDV抗原用0.05mol／LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释至5μg／ml，每孔加l00μl，置37℃温箱  小时后，再置4℃冰箱过夜。取出后倾去包被液，用PBS—T冲洗液洗涤3次，每次3～5min。加含10％BSA的PBS—T封闭液，每孔加l00μl，置37℃1h，倾去封闭液，同前洗涤。色被好的抗原板用塑料封装，放在一20℃冰箱保存。   
    (2)加被检血清  用血清稀释液按1：400稀释，加入ELISA反应板中，每孔加100μl。Al孔加稀释液，A2、A3孔加阴性血清，A4、A5孔加阳性血清。阳性和阴性血清不稀释，加  入量同被检血清。然后将反应板放在湿盒中，置37℃1h。
    (3)冲洗  倾去反应板中液体，用冲洗液洗涤3次，每次3～5min。
    (4)加兔抗鸡IgG酶标记抗体  取酶标记抗体lml加00ml酶标稀释液混匀后，再加  100ml灭菌甘油即成10X兔抗鸡IgG酶标记抗体，用安瓿分装每支lml(可放一20℃保存)。用时取出．1支加入9ml稀释液，每孔加入100μl，置37℃1h。
    (5)冲洗  方法同(3)   
   (6)加底物液  将底物液甲液加入乙液中，再加入30％过氧化氢液10μl，混匀后立即  加入反应板上，每孔100μl，37℃避光作用20min。   
    (7)加终止液  每孔加人50μl。
    (8)用酶标测定仪在波长492nm下，测定每孔降解物的吸收值。测定时A1孔调零。
    结果判定：被检血清两孔OD值平均值与阴性血清两孔OD值平均值之比，若被检血清OD值≥2者判为阳性。
    试验溶液溶液配制： (1)冲洗液 0.01molpH7.4PBS液配制；取KH2P041g，Na2HP0412H20 14.5g；KCll.0，NaCl42g，无离子水加至250ml溶解。
    (2)酶标抗体和血清稀释掖配制0.0lmolpH7.4PBS250ml，吐温20 2.5ml，硫柳汞 0.1g。混匀后，按每瓶l0ml分装，室温保存。  
    (3)封闭液配制  取(2)液250ml，BSAlg混匀按每瓶l0ml分装，一20℃保存。
    (4)底物液配制  甲液：取Na2HP04·12H2035.8g，加无离子水1000ml按每瓶6m1分装，室温保存。   
    乙液：取柠檬酸21g，加无离子水1000ml，再加邻苯二胺1.2g，按每瓶3m1分装，一20℃避光保存。
    (5)终止液2mol／L硫酸  取浓H2S04(纯度95％～98％)4ml加入32ml无离子水中混匀即成

风雨阳光

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captaincook

在用ELISA检测中，怎么只有实验步骤，没有对实验结果的分析。