禽病的实验室诊断

浪子豆角

禽病的实验室诊断

在家禽疾病临床诊断中，一般通过病历调查、临床检查和病理解剖对大多数家禽疾病作出初步诊断。但有时疾病缺乏临床特征而又需要作出正确诊断时，必须借助实验室手段或取样品送到相关防疫检查站、兽医站，帮助诊断。实验室诊断一般包括禽病的组织病理学、微生物学(包括细菌学检验、病毒学检验和血清学检验)、寄生虫学、生理生化学的实验诊断。在禽病中，由于以传染病为主，所以实验室诊断一般侧重于微生物学，特别是微生物学中的血清学诊断。血清学诊断是建立在抗原与相应抗体发生可见反应这一原理的基础上，有的反应不可见或难测，可以通过应用补体，溶血以及荧光素，酶和同位素标记等指示物质，使其反应成为可见或可测状态。血清学方法具有严格的特异性和较高的敏感性，在传染病的诊断、病原微生物的分类和鉴定以及抗原分析、免疫抗体监测等方面，均有较广泛的应用。即用已知的抗体，可以对分离获得的病原微生物进行鉴定。相反，通过已知的抗原对康复家禽，隐性感染家禽以及接种疫苗后的家禽的抗体消减进行定性和定量的监测。  

    血清学检验方法很多，常用的有凝集试验、琼扩试验、血凝试验、间接血凝试验、血凝抑制试验、补体结合试验、红细胞吸附和吸附抑制试验、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验(简称ELISA)以及免疫荧光试验等。本书对家禽病诊断常用方法作较为详细介绍，供专业户以及饲养厂(场)禽病防治的技术人员有选择性地使用。  
    一、凝集试验  
    (一)直接凝集试验  
凝集反应即细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应的抗体在电解质参与下，相互凝集形成团块，这种现象称为凝集反应。参与反应的抗体称为凝集素，抗原称凝集原。常有平板法、试管法、玻片法及微量凝集法等。  

    1.平板法  
    取洁净玻板一块，用蜡笔按试验要求划成数个方格，并注明待检血样的号码；用生理盐水倍比稀释血清，加入抗原，用牙签(或火柴棍之类)自血清量最少(血清稀释度最高)的一格起，将血清与抗原混匀，注意抗原用前摇匀，并置室内，使其温度达20℃以上。混合完毕用酒精灯稍微加温，使达30℃左右，5～8分钟内记录结果，按下列标准记录反应强度：  
＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透明。  
＋＋＋：有明显凝集片，液体几乎完全透明，即75％凝集。  
＋＋：有可见凝集片，液体不甚透明，即50％的凝集。  
＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25％凝集。  

-：液体均匀混浊，即不凝集。  
    该法为一种定量方法，常用于检测待检血清中的相应抗体及其效价。如一般以＋＋以上血清最高稀释度为该血清的凝集价。也用定性作为禽病阳性判定，协助临床诊断及流行病学的调查。  
注意：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。  
    2.试管法  
    该法操作时，将待检血清用相应生理盐水作倍比稀释，加入等量的已知抗原，充分混匀，放入37℃温箱或水浴锅中4～10小时，取出后放置室温数小时，观察并记录结果。  
判定方法与平板凝集法一致。  
    3.玻片凝集法  
    又称快速凝集反应，为一种定性试验，常用于鸡白痢的诊断及流行病学的调查中，也用于鸡传染性鼻炎，鸡慢性呼吸道病(霉形体病)等的诊断。现以鸡白痢玻片凝集试验为例进行示范说明：用滴管吸取标准诊断液(即鸡白痢凝集标准抗原)一滴(约0.05毫升)滴在洁净的玻片或干净普通玻璃上。刺破鸡冠或翅静脉或剪一鸡冠齿，采血一滴(约0.04毫升)，使之与诊断液混匀，可用牙签或火柴棍搅匀，或稍微靠在桌边缘摇动玻片，频频变动玻板水平位置，使混合均匀。  

    如在1～3分钟内细菌和红细胞从混合液滴的边缘开始逐渐凝集成较大的颗粒，呈片状、团块状，将红细胞凝集成许多小区，液体几乎完全透明，外观是花斑状，则判为阳性反应；如在2～3分钟之内不出现凝集现象，而且玻板上的混合液均保持原来的状态，或者中间部分较浓，四周较稀薄的混悬物，则可判为阴性反应。该反应温度条件在室温20～30℃进行。  
    类似的还可用血清进行快速凝集反应，其方法为选用洁净玻片或载玻片，下面衬以黑色展板，在玻片上滴一滴血清或相当凝集价的稀释血清，再滴一滴鸡白痢凝集标准抗原(诊断液)混合均匀，几分钟后观察凝集成块情况，判定阴阳反应。如阴性反应，则混和液保持一致混浊的红色。  

4.微量凝集法  
该方法原理均同试管凝集法，只是操作在微量滴定板(反应板)上进行，抗原、抗体用量很少，故称微量凝集试验，即用数根稀释棒并排在Ｕ型或Ｖ型微量滴定板上揉搓，将待测血清作系列倍比稀释，随后滴加抗原振荡混合，置37℃温箱或温室内一定时间(12～24小时)，判定结果方法同平板法。  
(二)间接凝集试验  
即将颗粒性抗原(或抗体)吸附于与免疫无关的小颗粒(载体)的表面，此吸附抗原(或抗体)的载体颗粒与相应的抗体(或抗原)结合，在有电解质存在的适宜条件下发生凝集现象。亦称被动凝集试验，常用的载体有动物的红细胞，聚苯乙稀乳胶活性炭等，吸附抗原后的颗粒称为致敏颗粒。现将最常用的间接血凝试验介绍如下：  

间接血凝试验是以红细胞为载体，将抗体(或抗原)吸附在红细胞表面，用来检测微量的抗原(或抗体)，吸附有抗体(或抗原)的红细胞也称致敏红细胞。间接血凝试验目前多采用微量法，可选用Ｕ型或Ｖ型微量反应板，将待检血清在血凝板试验用的反应板上用稀释棒或定量移液管作倍比稀释，再加等量致敏红细胞悬液，振荡混匀后，置于一定温度数小时或于25～30℃放置过夜，观察凝集程度。以出现50％凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝价。  
试验应设如下对照：①致敏红细胞加稀释液的空白对照；②已知阳性血清对照；③已知阴性血清对照；④未致敏红细胞加阳性血清对照。  

二、血凝和血凝抑制试验  
有许多病毒能够凝集某些动物和人的红血球，故可以此来推测待测材料中有无该病毒的存在。而有的能凝集血球的病毒，其凝集性可为相应的抗体所抑制，这种抑制具有特异性，故病毒的血球凝集抑制试验，可应用标准病毒悬液来检查被检血清中的相应抗体或应用特异性抗体鉴定新分离的病毒。由于只是一些病毒有血凝性，故血凝或血凝抑制试验只能用于那些有血凝性质的病毒，如鸡新城疫病毒，现以该病毒为例介绍血凝和血凝抑制试验的基本方法。  
1.血凝试验  
可采用96孔Ｖ型微量反应板或试管，将待测抗原从1：10开始作倍比稀释，每孔加入生理盐水0.05毫升，最后一孔不加抗原作对照，吸取0.5％的鸡红血球，依次加入每孔0.05毫升；混匀血球，静置室温(18～20℃)中15～30分钟,每隔5分钟观察一次结果，至60分钟时结束，根据血球凝集图形判定结果，凝集孔的血球会均匀分布凝于孔底周围，可见呈颗粒的伞状；不凝集孔的红血球全部集中于微量反应孔的最底点，呈一圆点。最后以能表现凝集病毒的最大稀释度为该待测抗原的血凝滴度，即凝集价。  

该法主要用于检测抗原的效价。  
2.血凝抑制试验  
采用固定抗原稀释法，每批抗原的血凝价通过血凝试验测定或按抗原说明书的血凝价稀释至一定浓度。操作方法：先取4单位抗原依次加入第一排2～11孔，最后孔滴加生理盐水，第一孔加抗原为8单位血凝价，然后用稀释器吸取待检血清对照孔混合后吸0.05毫升于第一孔，混合充分，依次倍比稀释，最后弃0.05毫升，则各孔均为4单位，置室温(18～20℃)下作用20分钟，再用移液器滴加0.5％红血球悬浮于各孔中，充分振荡混合后静置30分钟，观察和血凝试验一样。结果判断，以完全抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的抑制(HI)滴度。通常以以2为底的负对数(-log2)表示。  

该方法通常用来检查被检血清和鉴定未知病毒。  
三、沉淀试验  
可溶性抗原与相应抗体结合，在有电解质存在时可形成肉眼可见的白色沉淀线(或物)，该过程称为沉淀反应。参与沉淀反应的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。沉淀反应可分为固相和液相，液相沉淀反应中以环状沉淀反应为多见；固相沉淀反应中主要有琼脂扩散试验，对流免疫电泳试验。  
以下介绍在禽病中常用的琼脂扩散试验方法。  
所谓琼脂扩散反应，即将抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，引起抗原抗体结合形成肉眼可见的沉淀线的现象。琼脂为一种含硫酸基的多糖体，高温时能溶于水，冷后凝固形成凝胶，该凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，其孔径大小取决于琼脂浓度，如1％的琼脂凝胶的孔径为85微米，因此允许各种抗原或抗体在琼脂凝胶中自由扩散，当按一定比例加入的抗原和抗体相遇时，就会形成一条明显的沉淀线，而且一对抗原和抗体只能形成一条沉淀线，故该法常用来鉴定抗原、抗体及其效价。如用于传染性法氏囊病、减蛋综合症(EDS-76)、禽脑脊髓炎、鸡白痢的检查。  

方法：将清洁平皿(直径约9～10厘米)，置水平台上，倒入加热融化的1％缓冲琼脂15～20毫升，厚度约2.5～3毫米，注意勿倒出气泡，待冷凝后将琼脂平皿放置事先画好的带中央孔的六角形图案的纸上，用金属打孔器按图形位置打孔，再用针头或小镊子将孔内琼脂块挑出，外周孔直径为6毫米，中央孔为4毫米，孔距为3毫米；中间孔滴加标准抗原，周围孔滴加待检血清和阳性对照血清，加完样品后，将平皿置湿盒内，放室温(15～30℃)，观察2～3天。结果判定，标准阳性对照血清与抗原孔之间形成沉淀带，或干扰其毗邻的阳性血清沉淀带使其邻端向内侧偏弯者，判为阳性；与抗原孔之间不出现沉淀带，阳性血清相邻近的沉淀线仍为直线向外偏弯者，判为阴性。  

附一：  
pH7.4的0.01MPBS：   
Na2HPO4·RH22.9克 硫柳汞(防腐剂)0.1克  
KH2PO40.3克 蒸溜水 加至1000毫升  
NaCl 8.0克  
附二：  
1％缓冲琼脂：取优质琼脂1克加pH7.4的PBS100毫升，水浴煮沸30分钟，中间振荡数次，促其融化均匀。保存于4℃冰箱。  
四、红细胞吸附和红细胞吸附抑制试验  
又称红血球吸附和红血球吸附抑制试验。某些病毒如鸡痘病毒、正、副粘病毒等，在培养的细胞内增殖后，可使培养的细胞吸附某些动物的红细胞，而且只有感染细胞的表面吸附红细胞，不感染的细胞不吸附红细胞，因此可以作为这种病毒增殖的衡量指数。红细胞吸附现象也可被特异抗血清所抑制，故可作病毒的鉴定方法，尤其对一些不产生细胞病理变化的病毒，不失为一种快速有效的鉴定方法。  

操作方法：细胞经培养长成单层后，常规接种病毒，经一定时间培养，弃培养液，加0.4％～0.5％已洗涤的红细胞悬液，置室温(18～20℃)作用一刻钟(某些病毒置4℃或37℃)；加少量生理盐水，轻轻洗涤，去未吸附的红细胞，放在低倍显微镜下观察。如红细胞粘附于单层细胞中的感染细胞表面，病毒大量增殖时，可见整个单层细胞粘满红细胞，则均判为阳性。进行抑制试验时，用Ｈank’s液将经病毒接种培养后的培养液洗涤2次，然后加入1：10稀释的抗血清，室温或37℃30分钟后，弃血清，加入红细胞悬液，如上进行红细胞吸附试验，镜检红细胞吸附强度，与对照相比，完全抑制为阳性。  

附：Hank’s(汉克斯氏)液：  
原液甲一：  
NaCl 160克 MgSO4·7H2O 2克  
KCl 8克 MgCl2·6H2O 2克  
按顺序加入到800毫升双蒸溜水中，一物溶解后再加另一物。  
原液甲二：  
CaCl2 2.8克溶于100毫升双蒸溜水中。  
以上两液混合，加双蒸溜水达1000毫升,加2毫升氯仿防腐,保存于5℃。  
原液乙一：  
Na2HPO4·12H2O 3.04克 葡萄糖 20克  
KH2PO4 1.20克  
按顺序加入到800毫升双蒸溜水中。  
原液乙二：0.4％酚红液100毫升(0.4％酚红液将是0.4克酚红置乳钵中,边研磨边涂加入0.1N的NaOH11.8毫升;酚红应完全溶解，置于100毫升量杯中，最后加双蒸水至100毫升)。  

将酚红液与葡萄糖等混合液混合，加双蒸溜水至1000毫升，加入2毫升氯仿防腐，保存于5℃。  
按下列方法配成汉克斯氏液：原液甲1份，原液乙1份，双蒸溜水18份,此液在5℃下可存1个月。  
使用前以1.4％NaHCO?3(9磅10分钟灭菌过)，无菌操作，校正pH到7.4(依需要定)，大约每20毫升的Hank’s液加0.5毫升的NaHCO?3可达pH7.4，此时颜色为黄红色。  
五、补体结合试验  
可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂类、病毒等，与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可结合补体(是球蛋白，主要是r球蛋白)，但这一反应肉眼无法观察到，而通过加入溶血系统作指示系统，包括绵羊红细胞、溶血素和补体，通过观察是否出现溶血，来判断反应系统是否存在相应的抗原抗体，该过程称补体结合试验。参与补体结合的抗体称补体结合抗体。  

注意在预备试验及正式试验中，均需已知的强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清供滴定补体、滴定抗原或作对照用。  
六、病毒中和试验  
中和试验在家禽病毒病的诊断工作中，常用于用已知病毒来检查未知血清，也可用已知血清来鉴定未知病毒，还可用于中和抗体的效价测定，其原理：病毒(抗原)与相应的抗体中和以后，可知病毒丧失感染力，该反应具有高度的种、型特异性，而且一定量的病毒必须有相应量的中和抗体才能被中和。  
七、免疫标记技术  
利用某些能够通过某种理化因素易于检测的物质标记抗体，这些被标记的抗体与相应的抗原相结合，通过对标记物的测定，从而确定抗原的存在部分和定量。该技术目前广泛应用的主要有：免疫荧光技术、同位素标记技术(即放免沉淀)和免疫酶标技术(包括ELISA)等等。

小酷

不错很详细

勤奋好学

不错。

环丙沙星

学习了

沙粒

写得很好。如果带图片就更好了

刘定章

学习、学习

huayu619

如过再加上细菌学诊断和病毒学诊断就更好了