玉米赤霉烯酮对蛋鸡生产性能、蛋品质、卵巢功能和肠道菌群的影响

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1、简介

玉米赤霉烯酮 (ZEN)，也称为 F-2 毒素，是由镰刀菌属真菌产生的次级代谢产物。它在发霉的玉米、小麦、大麦、燕麦和大米中广泛存在，使其成为危害全球畜禽行业饲料安全的危险霉菌毒素之一。据报道，在中国市场采集的饲料样本中，85.2% 被ZEN 污染，平均水平为35至1478?g/kg 。撒哈拉以南非洲（SSA）的家禽业也面临饲料不安全问题，如肯尼亚，据报道，在家禽饲料原料和家禽饲料中检出 ZEN 的阳性率分别为83%和100%，平均ZEN 的水平分别为71.3?g/kg 和103.4 ?g/kg。

目前，ZEN已被证明具有肝毒性、免疫毒性、生殖毒性和遗传毒性，其中生殖毒性最为典型。

越来越多的证据表明，ZEN 及其代谢物由于其与雌二醇的结构相似性而表现出各种雌激素毒性。ZEN 对人和动物的配子发生和胚胎发育有毒，例如，在小鼠的饮食中添加0.8、4、10、40 ppm 的ZEN 可降低胎盘和胎儿的重量 。ZEN可引起雌性动物子宫增大、生殖道异常、生殖性能下降和生殖激素功能障碍，以及雄性动物睾丸萎缩和精子浓度下降，严重制约畜牧业的发展。猪、牛、羊和肉鸡的膳食 ZEN 摄入的不良后果已被广泛报道。与猪相比，家禽对 ZEN 的耐受性更高，这可能与 ZEN 的吸收率低、代谢物清除快以及肝脏产生的 β-ZOL 比例高有关。但在报告对繁殖性能和蛋鸡蛋质量的影响方面仍然存在局限性。因此，有必要了解 ZEN 对蛋鸡的风险。

胃肠道微生物群在维持动物健康和繁殖性能方面发挥着关键作用。肠道微生物群组成的调节已被证明可以缓解几种雌激素调节的疾病状态。霉菌毒素引起的肠道菌群失调与霉菌毒素中毒的发生有关。研究表明，霉菌毒素会导致有益肠道细菌的消除和致病菌的增强，从而对肠道微生物群的稳态造成负面影响。因此，探索暴露于 ZEN 后肠道菌群变化与 ZEN 导致的生殖性能下降之间的关系将是新颖而有趣的。

基于此，本研究旨在探讨不同浓度 ZEN对蛋鸡生产性能、蛋品质、卵巢功能（卵巢指数、卵巢病理特征和血清生殖激素）和肠道菌群的影响，并进一步从肠道菌群的角度探讨ZEN导致蛋鸡繁殖性能下降和卵巢损伤的潜在机制。本研究的结果可能为理解 ZEN 对蛋鸡产生不利影响的机制开辟了一条新途径，并为预防和控制 ZEN 对蛋鸡的危害提供了新的见解。

2. 结果

2.1 ZEN 对蛋鸡生产性能的影响

表 1.玉米赤霉烯酮对蛋鸡生产性能的影响。

星 期	项目	膳食中 ZEN 的补充水平，μg/kg
		BD	+250μg/kg ZEN	+750μg/kg ZEN
第 2 周	产蛋率 (%)	98.6±2.0	98.6±1.8	96.4±3.2
	采食量 (%)	109.9±1.3	110.2±1.7	109.8±1.3
	FCR（g料/g蛋）	1.86 ± 0.09	1.88 ± 0.04	1.99 ± 0.15
第 5 周	产蛋率 (%)	98.3±1.6	98.5±1.0	96.6±2.0
	采食量 (%)	109.2±1.1	109.4±2.1	109.7±0.8
	FCR（g料/g蛋）	1.83 ± 0.07	1.86 ± 0.04	1.91 ± 0.08

对照组蛋鸡饲喂以玉米豆粕为主的日粮（BD组）

如表1所示，在第 2 周，BD（对照组）、BD + 250ug/kg ZEN 和 BD + 750ug/kg ZEN 组的产蛋量和采食量没有显着差异（p > 0.05）。然而，与BD 组相比，添加750μg/kg ZEN 的基础日粮导致 FCR（料蛋比）显着增加（p < 0.05）。在第 5 周，各组产蛋量和采食量无显着变化（p > 0.05）。与BD 组相比，BD + 750 μg/kg ZEN 组的 FCR 显着升高（p < 0.05）。这些发现表明，高剂量的 ZEN 可能会加剧对蛋鸡生产性能的负面影响。

2.2.ZEN对蛋鸡蛋品质的影响

各组鸡蛋质量结果见表2。含250μg/kg和750μg/kg ZEN的日粮对蛋重、蛋指数、蛋黄颜色、蛋壳厚度和蛋壳强度没有显着影响（p > 0.05）。然而，ZEN 高污染组在第 5 周时蛋白高度和 Haugh 单位（p > 0.05）下降，而蛋黄颜色和蛋壳强度呈增加趋势。鸡蛋中ZEN的残留量见表3。与对照组相比，BD+250 μg/kg ZEN组和BD+750 μg/kg ZEN组均未检出ZEN及其代谢物残留。

表 2.玉米赤霉烯酮对蛋鸡蛋品质的影响。


表 3.玉米赤霉烯酮、α-ZOL、β-ZOL 残留在蛋黄中的影响。

项目	膳食中 ZEN 的补充水平，μg/kg
	对照组	+250μg/kg ZEN		+750μg/kg ZEN
ZEN	＜LOD		＜LOD		＜LOD
α-ZOL	＜LOD		＜LOD		＜LOD
β-ZOL	＜LOD		＜LOD		＜LOD

ZEN、α-ZOL、β-ZOL的极限检测（LOD）均为1?g/kg

2.3.ZEN对蛋鸡卵巢功能的影响

在这项研究中，卵巢组织的组织学切片、卵巢指数、输卵管指数和血清生殖激素被用来评估卵巢功能。与BD组相比，BD+250μg/kg ZEN组滤泡颗粒细胞层和膜细胞层结构不清，滤泡腔内可见少量坏死细胞。此外，BD+750μg/kg ZEN组卵巢表现为滤泡颗粒细胞层和膜细胞层结构不清，厚度明显增加，滤泡腔内大量细胞脱落并伴有部分细胞坏死（图 1）。如表4所示，与BD组相比，ZEN补充组的体重和卵巢指数呈下降趋势（ p >0.05）。ZEN 对输卵管指数没有显着影响（p > 0.05）。E、FSH、LH和P的血清水平见表5。三组血清E水平差异无统计学意义（p >0.05），而ZEN较BD组显着降低血清FSH水平（p <0.05）。对于血清 LH，日粮中补充 250 μg/kg ZEN 无显着影响（p > 0.05），但 BD + 750 μg/kg ZEN 组血清 LH 水平显着低于 BD 组（p< 0.05)。同时，与 BD 组相比，BD + 250 μg/kg ZEN 组（ p < 0.05）和 BD + 750 μg/kg ZEN 组（p < 0.05）的血清 P 水平均显着降低。



图 1.玉米赤霉烯酮对蛋鸡卵巢组织病理学的影响。BD，基础饮食；BD + 250 μg/kg ZEN，基础日粮补充250 μg/kg ZEN，黑色箭头：滤泡颗粒细胞层和膜细胞层结构不清晰，细胞空泡变性，黄色箭头：细胞坏死变性，红色箭头：少量坏死细胞在滤泡腔中可见；BD + 750 μg/kg ZEN，基础膳食补充剂含 750 μg/kg ZEN，黑色箭头：蛋白质粘液，蓝色箭头：滤泡颗粒细胞层和膜细胞层结构不清晰，厚度显着增加，细胞空泡变性，红色箭头：细胞坏死变性，黄色箭头：细胞在滤泡腔脱落，有一些细胞坏死。条形代表 200 μm。

表 4.玉米赤霉烯酮对蛋鸡卵巢指数和输卵管指数的影响。


表 5.玉米赤霉烯酮对蛋鸡生殖激素的影响

项目	膳食中 ZEN 的补充水平，μg/kg
	对照组	+250μg/kg ZEN	+750μg/kg ZEN
雌二醇（pg/mL）	449.28 ± 44.9	440.72 ± 19.8	451.08 ± 43.3
促卵泡激素（IU/L）	449.28 ± 44.9	440.72 ± 19.8	451.08 ± 43.3
促黄体生成素（ng/mL）	151.85 ± 12.4	145.84 ± 12.44	129.35 ± 6.7
孕酮（pg/mL）	485.7 ± 113.4	359.67 ± 64.04	286.56 ± 57.4

2.4.ZEN 对蛋鸡肠道菌群的影响

图2展示了不同浓度ZEN对盲肠细菌α多样性和β多样性的影响。如图 2A 所示，与 BD 组相比，250 μg/kg ZEN 和 750 μg/kg ZEN 的膳食添加显着减少了盲肠细菌的 OTU 数量（p < 0.05）。如Chao1指数和ACE指数（图2B，C）所示，ZEN处理组盲肠细菌多样性显着降低（p <0.05） ，而香农指数表明细菌多样性有降低趋势（p > 0.05） （图 2D)。OTU 水平的主成分分析 (PCA) 的结果揭示了组间微生物群结构的明显差异，基于 bray curtis 的非度量多维尺度 (NMDS) 提出了类似的发现。此外，分别在门和属水平评估了每组的细菌相对丰度（图3）。



图 2.玉米赤霉烯酮对蛋鸡肠道菌群 ( A ) OTU 数量， ( B – D ) 基于 Chao1 指数 ( B )、ACE 指数 ( C ) 和 Shannon 指数 ( D )的肠道细菌α 多样性， ( E ) OTU 水平上β多样性的PCA 图， ( F）基于布雷柯蒂斯的 OUT 级别的 NMDS。*，p < 0.05，**，p < 0.01。注意：α多样性是衡量个体微生物组多样性的指标。

图 3.玉米赤霉烯酮对蛋鸡肠道菌群组成的影响。( A ) 肠道菌群中门的相对丰度，( B ) 肠道菌群中属的相对丰度，( C ) 三组优势属的比较，( D ) 基于门到属水平的LEfSe bar (LDA > 2) . *，p < 0.05。



如图3A所示，厚壁菌门的相对丰度最高的是在门水平的蛋鸡肠道菌群中，约占50-60%。相对丰度第二高的细菌是拟杆菌，约占 30-40%。在其中一组中，放线菌、Tenericutes、Verrucomicrobia、Proteobacteria、Patescibacteria 和蓝细菌的相对丰度至少大于 1%。在门水平上，各组之间的细菌丰度没有显着差异（数据未显示）。在属水平上进一步分析，观察到相对丰度大于1%的细菌28个（图3B），其中norank_f__Muribaculaceae的相对丰度在 ZEN 补充组中显示出剂量依赖性显着增加，而在 Candidatus_Saccharimonas 的相对丰度中观察到相反的趋势（图 3C）。图3D所示的门到属水平的LEfSe 结果表明，BD 组中的优势细菌是f_Barnesiellaceae和g_Hydrogenoanaerobacterium。g_Fournierella是 BD + 250 μg/kg ZEN 组中的主要细菌。BD+750 μg/kg ZEN组的优势菌数显着高于其他两组。

为了研究肠道微生物群组成和丰度对功能变化的影响，使用 KEGG 数据库进行功能预测。如图 4A所示，ZEN 对 KEGG 1 级的 6 条通路没有显着影响。有趣的是，碳水化合物代谢、复制和修复、免疫系统和环境适应 4 条通路在 KEGG 2 级有显着差异（图4B）。此外，在这四种途径的第 3 级，有 7 种途径显着不同。热图结果显示，BD 和 BD + 250 μg/kg ZEN 组在功能上更加相似，表明更高浓度的 ZEN 对肠道菌群功能的影响更大（图4C）。


图 4.玉米赤霉烯酮对 KEGG 1 级 ( A )、2 级 ( B ) 和 3 级 ( C ) 肠道微生物群功能谱的影响。*，p < 0.05，**，p < 0.01。

2.5.蛋鸡肠道菌群与繁殖性能及卵巢功能衰竭的相关性

接下来，应用 Spearman 的相关性分析，进一步研究了优势细菌与 ZEN 诱导的生产性能下降以及各组卵巢功能障碍之间的关联（图5）。BD组g_Barnesiella与卵巢指数、LSH水平呈显着正相关，与生产性能、蛋质指标呈负相关。总体而言，BD组中除f_Barnesiellaaceae和g_Hydrogenoanaerobacterium外，其他4种属水平优势菌与生产性能、卵质量和卵巢功能呈正相关。，与蛋壳强度呈显着负相关。对于BD + 250μg/kg ZEN组，优势菌g_Fournierell与LH呈显着正相关，与其他指标的相关性均不显着。有趣的是，BD + 750μg/kg ZEN 组中的优势细菌与每个指标总体呈负相关，g_Odoribacte和f_Muribaculaceae与蛋重、蛋白高度和 Haugh 单位显示出主要的负相关关系。


图 5.肠道微生物群与玉米赤霉烯酮引起的蛋鸡生产性能、蛋质量（第 5 周）和卵巢功能损害的相关性。* p < 0.05，** p < 0.01 和 *** p < 0.001 表示显着相关。

致谢本文原作者：Tao Yuan, Junyi Li, Yanan Wang, Meiling Li, Ao Yang , Chenxi Ren, Desheng Qi and Niya Zhang，袁涛 李俊义等译。

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