兽药药敏试验--药敏片及培养基制备关键点

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细菌对药物的敏感试验，是指测定抗菌药物在体外对病原微生物的生长有无抑制或杀灭作用的方法，简称药敏试验。常用的药敏试验方法有纸片法和试管法等。纸片扩散法简便易行，是生产中选择用药常用的药敏试验方法；试管法对于检验药物的抗菌效果更为准确可靠，可用于药物采购前的药效检验。经试管法检验对多种病原菌或主要的病原菌有效的药物，可做成药敏纸片备用。纸片法的操作程序如下:

01

试验材料
普通恒温培养箱、无菌室或超净工作台；普通营养琼脂培养基或MH琼脂培养基或血液琼脂培养基；杭州新华 101号定性滤纸、打孔器、西林瓶；手术剪刀、酒精灯、接种环、镊子、灭菌平皿、手术盘、灭菌的棉签、酒精棉球、自封袋、记号笔等；待检组织病料。

02

试验前准备

1、药敏纸片的制备
制备纸片取杭州新华 101号定性滤纸，用打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。以每瓶100片的数量，放入干净的西林瓶中，用多层报纸包扎瓶口。160℃干热灭菌 2h或121℃高压灭菌15min，置60℃干燥箱内烘干备用。
药物浓度抗生素药物根据《抗微生物药物敏感性试验执行标准2010》进行配制，商品药物应根据其使用说明书进行配制，按照实际使用量的4倍进行配制。
操作方法以每张滤纸片饱和吸水量为0.01ml进行计算，每100张滤纸片加入药液1ml，使滤纸将药液均匀吸净，置4-8℃冰箱浸泡1小时左右，再将西林瓶置37-50℃的温箱内2-3天烘干；或浸泡药液后取出纸片散开摊于已干热灭菌的空平皿中，无菌室过夜，待纸片干燥后，装入西林瓶内，密封。
对干燥过程中容易失效的药物应采取现场制作，即将配制好的药液用微量加样器取100μl加入10片备用纸片浸泡，浸泡后马上用于抑菌试验。
药敏纸片的保存日常使用的小量纸片应置于含干燥剂的密封容器内4℃保存，可保存约1个月。长期储存时应密封存放于-20℃环境中，使用时从低温环境中取出后，放置平衡到室温后才可打开，用完后应立即将纸片放回冰箱内的密封容器内。-20℃保存的药敏片可用6个月。

2、培养基的制备
药敏实验的培养基可选用普通营养琼脂培养基（一般菌选用）、MH琼脂培养基（大多数菌生长良好）或血液琼脂培养基（检测营养要求较高的菌选用）。制备时严格按照培养基说明书使用蒸馏水进行配置。注意在配置时一定要混合均匀后放入微波炉或使用万用电炉加热至沸腾。使用封口膜或棉塞进行封口（防菌），外层用报纸进行包装（防水），放入高压锅中进行灭菌。将灭菌后的培养基和培养皿放入超净台中，待培养基不烫手时（60℃左右）将其倒入培养皿（提前标记好制作日期和培养基名称）中，厚度为3-4mm。晾干、待其凝固后放入37℃恒温箱中倒置烘20小时。取出培养皿,放入自封袋封好放冰箱4℃保存，待检测时用（注：不要放太长时间，以免水分流失太多）。

3、营养肉汤制备
成分牛肉膏3-5克；蛋白胨10克；氯化钠5克；蒸馏水1000毫升；
制法取上述成分加热至溶解，并矫正PH为7.6之后继续加热10分钟。待溶解液中无明显残渣则可用滤纸（滤纸折叠成扇形或漏斗形）进行过滤，若还有原料残渣浮于液体当中，则需继续加热，直至无明显原料残渣时再进行过滤。用滤纸过滤后分装到试管中，用报纸或牛皮纸包扎后放入高压蒸汽灭菌器，121℃灭菌20分钟后备用。如果为成品的营养肉汤，直接按照说明书要求进行配置，待其完全溶解后分装到玻璃试管（直径18mm）中，每管以3ml为宜。塞上试管塞，用报纸进行包装，竖立放到高压锅中进行灭菌。

4、病料的采集与处理
打开病鸡或新鲜死鸡的腹腔，以无菌操作的方法，采取有明显病变部位的组织，直接放到灭菌的培养皿中（或一次性自封袋中），如病死鸡的肝、脾、心、气囊膜、眼球液、腹水、关节渗出液及脓液、输卵管内容物等病料，立即进行检测，如不能及时进行检测需将病料放到0-4℃保存待检，不得超过24小时。若24小时内未能进行检测，需将病料置-20℃保存。

来源：惠中兽药

常老师1

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