鸡源大肠杆菌的耐药性监测

网友洛阳

  鸡大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌(E.coli)的某些致病性菌株所引起的多种疾病的总称，多采用抗生素类药物治疗。由于抗生素的广泛及不合理应用，细菌耐药性日趋严重，特别是多重耐药现象更加严重。近年来氟喹诺酮类抗菌药以抗菌谱广、口服吸收快、生物利用度高、组织分布广、半衰期长等特点受到广大兽医和医学工作者的青睐，在临床治疗中已成为很多感染性疾病的首选药物。但随着它的广泛持续应用及不当使用，其耐药性也在迅速增长，严重影响了喹诺酮类药物的疗效和临床应用。为了解和掌握鸡群中耐药菌株的产生情况和耐药程度，并为临床上有效预防和治疗药物和筛选提供依据，同时为建立简便、实用的监测方法奠定前期研究工作基础，我们从石家庄四个鸡场发生大肠杆菌病的鸡群中分离出180株大肠杆菌，对其耐药性进行了检测与分析。?

1  材料与方法?

1.1  鸡源大肠杆菌的分离与鉴定  180株鸡源大肠杆菌分离菌株，分离自石家庄4个鸡场的不同日龄、经剖检初诊为大肠杆菌病的病死鸡的肝、、脾、输卵管等部位及死胚的卵黄囊，按文献［4］介绍的方法进行分离，并经形态学、生化反应检查，鉴定为大肠杆菌。

1.2  药敏试验质控标准菌株  大肠埃希氏菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单孢菌ATCC27853，肠球菌ATCC29213，来自美国FDA兽医中心，本实验室保存。?

1.3  培养基  MH肉汤系杭州天和微生物试剂有限公司生产，普通营养琼脂上海市医学化验试剂厂生产。?

1.4  抗生素(标准品)  除链霉素、阿米卡星、头孢噻酚，及合成菌药左氟沙星购自中国药品生物制品鉴定所外，其余系Sigma?Aldrich 公司产品。抗生素种类、配制、稀释范围及药敏试验判断标准(按美国临床实验室标准化委员会1999年标准)见表1。

表1  抗菌药物(标准品)种类、配制、稀释范围及药敏试验判定标准

抗生素名称 含量   储存液          使用液    稀释范围?         MIC值
浓度（μg/ml） 浓度(μg/ml) （μg/ml） （S）敏感 (I)中敏 (R)耐药
链霉素  713μg/mg  5 300        1 024      256～0.25    ≤32             ≥64
卡那霉素797IU/mg  12 800       512        28～0.125    ≤16      32      ≥64
庆大霉素651IU/mg  12 800       64         16～0.125    ≤4       8       ≥16
氨苄青霉素 96.5%  12 800       128         32～0.25    ≤8      16       ≥32
萘啶酸     84.8%  12 800       1 204       256～2      ≤8      16       ≥32
四环素      95%  12 800        128         32～0.25    ≤4      8        ≥16
氯霉素    98.6%  12 800        128        32～0.25     ≤8      16       ≥32
氟苯尼考    99%  12 800        64         16～0.125   ≤2       4        ≥8
阿米卡星930IU/mg 12 800       256        64～0.5      ≤16     32        ≥64
头孢氨噻肟95%    6400         64         16～0.015    ≤8      16       ≥32
头孢噻酚  89.4%   12 800      128        32～0.25     ≤8      16       ≥32
头孢噻呋 914IU/mg 12 800      64         16～0.125    ≤2      4        ≥8
头孢曲松  84.7%   12 800      256        64～0.063    ≤8      16       ≥32
头孢力新 995IU/mg 640         128        32～0.25     ≤8      16       ≥32
环丙沙星  98.7%   12 800      64         16～0.015    ≤1      2        ≥4
沙拉沙星  88.5%   6 400       64         16～0.015    ≤1      2        ≥4
恩诺沙星  96.4%   1 280       64         16～0.015    ≤1      2        ≥4
罗比沙型  95.2%   3 200       64         16～0.015    ≤1      2        ≥4
左氟沙星  97.2%   3 200       64         16～0.015    ≤2      4        ≥8
阿莫西林989 IU/mg 12 800     64         32～0.25     ≤8      16        ≥32

1.5  药敏试验  按WHO推荐的微量稀释法做适当改动进行。在普通营养琼脂平板上挑取单个菌落接种于3 ml MH肉汤管，37℃培养3.5～4 h，使其OD 600值达到0.25～0.3，取50 μl用MH肉汤作1∶600倍稀释，备用，稀释液必须在15 min内加入反应体系。在96孔酶标板的每孔加MH肉汤50 μl，然后在酶标板第一排孔加20种抗生素使用液50 μl，每种抗生素占一孔，用八道移液器混匀，吸取50 μl加入第2排孔，混匀后，吸取50 μl加入第3排孔，以此类推至第11排孔，第11排孔混匀后吸取50 μl弃去。将已校正浓度的待测菌液依次加入酶标板的第1～11排孔中，盖盖儿，震荡0.5～1 min，装入封口塑料袋，37℃培养16～18 h后观察结果。每次试验用四种质控标准菌株作对照。?

2 结果?

2.1 鸡源大肠杆菌耐药率分析  在所使用的20种抗菌药物中，180株分离菌株对萘啶酸、四环素、氨苄青霉素和阿莫西林表现出很高的耐药率，耐药率分别为93.3%、88.9%、72.8%和71.7%。此外，罗比沙星（64.4%）、沙拉沙星（62.8%）、链霉素（61.7%）、卡那霉素（61.7%）、恩诺沙星（58.9%）、庆大霉素（55.6%）、左氟沙星（53.9%）的耐药菌株也已十分普遍。氯霉素(25%)、头孢噻吩(9.4%)、头孢力新(4.4%)的耐药率较低（表2）。所有分离菌株对头孢曲松、氟苯尼考、头孢氨噻肟、头孢噻呋、丁胺卡那等5种抗生素都敏感。

表2  180株鸡源大肠杆菌对20种抗菌药物的耐药率(%)

抗菌素          耐药率
萘啶酸      93.3（168/180）
四环素      88.9（160/180)
氨苄青霉素  72.8（131/180）
阿莫西林    71.7（129/180）
罗比沙星    64.4（116/180）
沙拉沙星    62.8（113/180）
链霉素      61.7（111/180）
卡那霉素    61.7（111/180）
恩诺沙星    58.9（106/180）
环丙沙星    56.7（102/180）
庆大霉素    55.6（100/180）
左氟沙星    53.9（97/180）
氯霉素     25（45/180）
头孢噻吩   9.4（17/180）
头孢力新   4.4（8/180）
头孢曲松   0(0/180)
氟苯尼考   0(0/180)
头孢氨噻肟 0(0/180)
头孢噻呋   0(0/180)
阿米卡星   0(0/180)

2.2  鸡源大肠杆菌对20种抗菌药物的耐药谱分析  在180株分离菌株中，除8株分离菌株对20种抗菌药物都敏感外，其余172株表现出对2种或多种抗菌药物有耐药性，0～4耐菌株为23株(12.8%)，5～8耐菌株占63株(35%)，9～12耐菌株有80株（44.4%），13～15耐菌株为14株（7.8%）。其中，7耐和11耐菌株所占比例较大，为13.9%，其次是10耐（11.1%）、12耐（10.6%）、9耐(8.9%)、6耐(8.3%)、8耐(6.7%)和5耐(6.1%)。在大肠杆菌耐药菌株中，共有57种以上的耐药谱型，大多数为多重耐药菌株，其中有1株表现出对15种抗菌药物有耐药性。?

3  讨论
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3.1  从本试验结果可以看出，临床上应用较多的萘啶酸、四环素、氨苄青霉素、阿莫西林、环丙沙星等的耐药菌株占很大的比例，只有应用较少或尚未使用的阿米卡星、头孢氨噻肟、头孢噻呋、头孢曲松、氟苯尼考等对大肠杆菌有高度的敏感性。因此建议在临床上应停用已普遍产生耐药性、临床上已明显无效的药物，选用目前应用较少、经药敏实验证明对大肠杆菌敏感的药物。大量耐药菌株的产生，已给养鸡业造成了巨大的损失。所以对病原菌进行耐药性检测势在必行。只有这样才能有针对性的选用敏感药物。另外，还应考虑采取联合用药、交叉或轮换用药等方法。?

3.2  对180株大肠杆菌所作的20种抗菌药物的药敏试验结果表明，180株分离菌株中，除8株细菌外，都表现出不同程度的耐药性。在这些菌株中，7耐、10耐、11耐、12耐菌株居多，分别为13.9%、11.1%、13.9和10.6%，5～12耐菌株占分离菌株的79.4%,说明鸡源大肠杆菌的耐药性以多重耐药为主，且对抗生素或抗菌药物的耐药性已相当严重。
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3.3  药敏试验结果表明，在多重耐药菌株中，对环丙沙星、恩诺沙星、左氟沙星、沙拉沙星、罗比沙星的耐药率非常接近，尽管后3种抗菌药物在菌株分离场从未使用过。这一结果说明氟喹诺酮类药物交叉耐药现象很严重，这一点从其耐药机制可以说明。氟喹诺酮类药物的耐药机制可能主要起因于染色体基因突变，包括与DNA旋转酶（DNA gyrase）合成有关的结构基因如gyrA、gyrB的点突变及与细胞膜通透性或药物主动外排系统有关的调控基因发生突变，从而导致细菌对氟喹诺酮类药物产生不同程度的耐药性。大肠杆菌对氟喹诺酮类药物交叉耐药现象的存在，提示在临床上应用该类药物时，当1种药物无效时不应更换使用同类药物。?

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