板蓝根凝集素的分离及其对小鼠免疫功能的影响

猪年

张　明[sup]1  [/sup]，蒋培红[sup]2*  [/sup]

（1.山东菏泽学院生命科学系，山东菏泽 274015；2.山东菏泽学院动物医学系，山东菏泽 274015）

摘　要：采用丙酮盐溶液及硫酸铵分级沉淀法对生药板蓝根进行凝集素的粗提，并对其部分性质进行了研究。结果表明，在pH  8和NaCl浓度为0.6  mol/L时提取的凝集效果最好，20%硫酸铵分级沉淀凝集最多；丙酮盐溶液的可溶性糖含量和还原性糖含量分别是20.45%和3.40%；硫酸铵提取物的可溶性糖含量为0.03%，但还原性糖含量很低；丙酮提取液组小鼠巨噬细胞的吞噬指数和吞噬百分率明显高于对照组。
关键词：板蓝根；凝集素；吞噬指数；吞噬百分率
凝集素在研究细胞膜的结构功能、分子识别、动物细胞免疫和抗虫抗性等方而的应用正在不断扩展，日益引起重视。国内已从棉花、芦荟、豆科作物和小麦等材料中提取得到凝集素[sup][1-3][/sup]。对它们的特性进行了研究，目前所知的凝集素都是生物活性蛋白，是一类非免疫原的蛋白质，大多数含有共价结合的糖，能与细胞表面糖蛋白的糖链专一性结合。而板蓝根的研究主要集中在成分分离及药理和性质上[sup][4-6][/sup]，而对凝集素方面国内外研究很少。板蓝根是十字花科植物，具有清热、解毒、凉血消疼、利喉消肿和提高免疫之功效，但这些作用是否与凝集素有关？本文通过丙酮和硫酸铵沉淀法对板蓝根进行粗提及其对部分性质的研究，为开发中药板蓝根凝集素活性剂提供理论基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
板蓝根未经炮制，菏泽本地所产；小鼠购于荷泽医专，40只，雌雄各半。
1.2　板蓝根生药粗提液的制备
采用丙酮提取法。板蓝根生药经粉碎、丙酮脱脂后，分别用不同浓度pH缓冲液及不同氯化钠盐溶液以1∶10(w/v)的比例进行浸泡，然后用磁力搅拌器搅拌30  min后，置冰箱4 ℃过夜，再经冷冻1  000 r/min离心10  min，取上清液待测。  
1.3　硫酸铵分级沉淀
称取适量硫酸铵，电磁搅拌下缓慢加入样品浸泡液中，待硫酸铵完全溶解，此溶液硫酸铵饱和度为
20%，倒入离心管中离心10  000 r/min 离心5  min，收集沉淀物，取上清液，按此方法继续向上清液中加入硫酸铵，使上清液饱和度依次达40%、60%，收集每次离心的沉淀物，并测定凝集活性。
1.4　血凝活性测定
参照文献[1]的方法略有改动。
1.5　糖含量的测定
可溶性糖含量(%)＝C  ×V/(W×10[sup]－9[/sup])×100%＝ (C×10[sup]－2[/sup]/W)%
还原糖含量(%)＝样品还原糖含量(%)(5  mL糖提取液中葡萄糖数(mg) ×2/样品用量)%。
1.6　小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
将40只小鼠随机分成2组，每组20只，雌雄各半，试验组灌服提取液0.5  mL/只，对照组灌服等量的蒸馏水，连续免疫7 d。具体方法参照文献[7]略有改动。   
2　结果
2.1　丙酮提取液凝集情况
结果见表1和表2。   

表1　不同pH缓冲液凝集现象

Table  1 The agglutination titers in different  pH value

  

pH                  pH value	凝集效价                   Agglutination         titer	对照                  Control	pH                   pH value	NaCl浓度                   NaCl content	凝集效价                   Agglutination         titer	对照                  Control
2.8                   4.0                   6.8                   8.0	2[sup]4[/sup]                  2[sup]1[/sup]                  2[sup]3[/sup]                  2[sup]5[/sup]	—                  —                  —                  —	                                        8.0	0.2                   0.4                   0.6                   0.8                   1.0	2[sup]0[/sup]                   2[sup]0[/sup]                   2[sup]6[/sup]                   2[sup]3         [/sup]          2[sup]4[/sup]	—                  —                  —                  —                  —

表2　不同盐浓度的凝集现象

Table  2 The agglutination titers in different saline solution

  

pH                           pH value	饱和度(%)                   Saturation degree	结果                   Result
                    2.8                                                           8.0	20%                   40%                   60%                   20%                   40%                   60%	从0.2mol/L提取液到1.0mol/L的凝集逐渐增多                   0.2mol/L提取液中凝集最多，其次是0.4mol/L                   基本看不到凝集                   0.2mol/L的Nacl凝集最多，其它都较少                   0.6mol/L的Nacl溶液中凝集最多，其它无                   基本没有凝集

   

从表1可以看出，在不同pH条件下，生药板蓝根的丙酮粗提效果不同，以pH  8时的效果最好，pH 2.8时效果较好，其凝集效价为2[sup]4[/sup]，而pH  2.8时效果最差。
从表2可以看出，在最适pH  8的条件下，通过添加不同浓度的盐溶液，0.6  mol/L NaCl凝集效果最佳，其凝集效价达到2[sup]6[/sup]，1.0  mol/L NaCl凝集效果较好，其凝集效价达到2[sup]4 [/sup]，而0.2 mol/L和0.4  mol/L NaCl基本没有出现凝集现象。
2.2　硫酸铵沉淀凝集情况
从表3可以看出，不同浓度的硫酸铵沉淀的凝
集素效果不一样，大体上说20%饱和度的硫酸铵凝集效果最佳，40%次之，60%基本没有出现凝集，至于60%以上的饱和度有待于进一步研究。
2.3　糖专一性抑制试验结果
从表4可以看出，板蓝根凝集素是一种具有高度专一性的糖蛋白，能被N-乙酰葡萄糖胺所专一性抑制，而葡萄糖、甘露糖、半乳糖和岩藻糖对其凝集活性无影响。
2.4　样品糖含量测定结果
从表5可以看出，丙酮盐溶液的可溶性糖含量20.45%，还原性糖含量为是 3.4%；而硫酸铵提取物的可溶性糖含量为0.03%，但还原性糖含量很低，说明丙酮盐溶液的提取多糖效果要优于硫酸铵盐溶液。
2.5　板蓝根凝集素吞噬试验结果
由表6可以看出，通过t检验，灌服丙酮提取物的小鼠体重与对照组的差异显著，而吞噬百分率和吞噬指数与对照组差异显著，说明板蓝根凝集素在不同程度上激活了小鼠腹腔巨噬细胞，导致小鼠巨噬细胞吞噬能力加强。
   

表3　不同饱和度硫酸铵的分级沉淀

Table  3 The fractional precipitation in different saturation degree of ammonium  sulphate

  

	葡萄糖 甘露糖 N-乙酰葡萄糖胺                  Glucose         Seminose N-acetylglucosamine	半乳糖 岩藻糖                           Galactose Fucose
丙酮提取液                  Acetone extract                  硫酸铵提取液                   Ammonia         sulfate extract	— — +                                      — — +	— —                                    —  —

  表4　板蓝根提取液血凝抑制试验

Table  4 Hemagglutination-inhibition test  of extracting solution of Radix  isatidis

  

 	板 可溶性糖含量                   reducing sacchari                   丙酮提取物 硫酸铵提取物                   Acetone extract Ammonia sulfate extract                    	还原性糖含量                           soluble         saccharide;                   丙酮提取物 硫酸铵提取物                  Acetone         extract  Ammonia sulfate extract                   
样品重量(g)                           Weight (g)                  OD 值                  OD value                  糖含量(%)                  Sugar         content	1.98 2.00                                    0.89 0.04                                    20.45 0.03	1.72 1.96                                    0.76 0.04                                    3.40 —

表6　板蓝根丙酮粗提液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

Table 6 Effect of acetone extract onmacrophage phagocytic  function    

  

 	动物数Anima         lnumber	体重(g)                   Weight         (g)	吞噬百分率(%)                   pyagocytic         percentage rate（%）	吞噬指数(%)                   pyagocytic         index(%)
对照                  Control                           丙酮提取物                  acetone         extract                  T(t) 值                  T(t) value                  P(p) 值                  P(p) value	20                                     20	21.56±1.89                                     22.41±2.34                                     1.42                                     >0.05	35.85%±2.75                                     42.31%±2.07[sup]*                  [/sup]                            4.45                                     <0.05	69.53±5.07                                       85.56±6.99[sup]*          [/sup]          [sup] [/sup]                  4.68                                     <0.05

注：①“*”表示显著水平；②“**”表示极显著水平。
Note：①“*” Means significont at the level of 0.05；②“**” Means significont at the level of 0.01.
3　讨论
3.1　通过丙酮和硫酸铵不同提取方法对生药板蓝根进行提取，可以确定板蓝根中确实有凝集素，其凝集效价最高为2[sup]6[/sup]。
3.2  板蓝根凝集素是一种专一性很强的糖蛋白，只对N-乙酰葡萄糖胺专一结合，其游离糖含量很低，可能主要是凝集素上的糖是大多数是结合糖，凝集素对细胞识别、细胞免疫及肿瘤的抑制有很大的作用，这些功能有待于进一步的研究。
3.3　通过板蓝根提取液灌胃小鼠试验，结果表明，板蓝根提取液对小鼠的体重无影响，说明少量的板蓝根提取液对小鼠无毒害作用，但其使小鼠巨噬细胞吞噬能力加强，巨噬细胞是机体免疫的关键细胞，它承担着摄取处理和递呈抗原的重要作用，并直接对靶细胞产生特异性的杀伤作用[sup][9][/sup]。巨噬细胞表面有多种介导细胞间相互作用的受体，而多糖能通过多糖受体使巨噬细胞活化[sup][10][/sup]，激活的巨噬细胞可以增强淋巴细胞的免疫生物学活性从而达到抗菌消炎、抗内毒素、抗肿瘤作用，还有促进机体免疫功能等重要作用，这些很可能与板蓝根凝集素糖蛋白激活巨噬细胞有关，有待于做进一步的研究。

 
参考文献（略）
  　  

王留英

谢谢总版的帖子，不过那些数据是否能重新整理一下？这样看着会更明白些。辛苦，拜读。