血凝-血凝抑制实验测抗体

张桂芝 · 发表于 2011-1-4 15:18:37

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血凝（HA）和血凝抑制（HI）方法测卵黄抗体
现在养殖场越来越重视防疫，很多基层兽医朋友和养殖场询问抗体检测的方法，下面是我的经验总结，由于表格发不上去，有需要的，可以联系我邮件索要。
对于产蛋鸡来说，使用卵黄测抗体的方法对鸡不产生应激，操作简单，节省人力。操作方法得当，与血清抗体的误差范围大致相当。但是，由于卵黄本事的特性比较粘稠，如果操作不当，容易造成比较大的偏差。在使用卵黄测抗体的时候，有两个步骤必须多加注意。下面以新城疫为例介绍。
1、样品的采集：使用鸡蛋测抗体，采集鸡蛋时必须做到能代表大群的健康状况，所以鸡舍的各个部位、向阳背光、上中下层、蛋壳质量好坏等因素都要考虑到。样品可以按5‰来采集，但一组样品最少数量不能少于8份，否则不具有统计学意义。群体超过10000的，可以按3‰采集。
2、 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水或PBS液)洗涤。再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。0.7%是一个相对数字，可以根据习惯选择0.5%~1%之间的任意稀释度，但同一次使用的红细胞必须一次配好。
红细胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠(SHOO)0.80克，柠檬酸(2H20)0.055克，氯化钠0.42克，蒸馏水加至100毫升，115磅高压灭菌15分钟，放4℃冰箱保存。
3、血凝（HA）实验测定抗原效价。主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。
① 首先用移液器向微量板每个孔加入稀释液25μL。
② 用微量移液器取病毒抗原25μL，加入第一孔，反复抽动3次后，吸出25μL加入第二孔，在第二孔反复抽动3次后，吸出25μL加入第三孔，如此连续稀释至第十一孔后吸出25μL弃去。第12孔不加病毒液为红细胞空白对照。
③ 每孔加入0.7％细胞悬浮液25μL，振荡混匀，静置反应，观察结果。
判断：沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
如上例：病毒液的HA效价以出现完全凝集的抗原最大稀释度为准。HI试验时，病毒抗原液为25μL内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成64／4=16倍的稀释液。

孔号：    1    2    3    4    5    6    7    8    9    10    11 12
滴度：    1:2 1:4 1:8 1:16  1:32  1:64  1:128  1:256  1:517 1:1024 1:2048  对照
稀释液    25 25 25    25 25 25 25    25    25    25    25    25
抗原(病毒) 25 25 25    25 25 25 25    25    25    25    25

红细胞悬液  25 25 25    25 25 25 25    25    25    25    25    25
作用时间与温度    轻轻振荡1-2min       静置30-60min
结果 +++  +++ +++ +++ +++ +++ ++ ﹣    ﹣ ﹣    ﹣    ﹣
注意：+++为完全凝集 ++为部分凝集 — 为不凝集

4、红细胞凝集抑制试验(HI试验)测定卵黄或血清中抗体水平：
（1）卵黄抗体的准备：鸡蛋中卵黄抗体在鸡排卵前与血清抗体是一致的，但卵黄排入输卵管后，与母体不再有联系，所以卵黄抗体与排卵前血清中的抗体是一致的，也就是与鸡蛋产出前一天血清抗体一致。由于卵黄比较粘稠，用移液器吸取非常困难，所以要预先做2倍稀释。
根据所测样品的数量取青霉素小瓶，每瓶加入稀释液1ml。准备1ml的注射器1支，去掉针头。将鸡蛋打入培养皿中，暴露蛋黄。用1ml注射器插入蛋黄，缓缓抽取蛋黄液1ml，加入青霉素小瓶中，反复抽吸混匀。用另一培养皿盛取稀释液洗涤注射器后，用同样方法继续稀释下一卵黄。
（2）微量板中每孔加入稀释液25μL。
（3）用移液器吸取稀释好的被检卵黄抗体或血清25μL注入第一孔，抽放3次后，吸出25μL，注入第二孔，如此连续稀释至第10孔，并从第十孔吸出25μL毫升弃去，血清稀释倍数依次为1：2～1024，11孔和12孔空白。
注意：日龄越高的母鸡一般抗体水平越高，现在检测的抗体滴度高于12的状况时有发生。对于日龄大或疑似发病的鸡群，建议使用两块微量板横着作稀释，共16孔，可以稀释14孔，第15与16孔做阴阳性对照。
（4）每孔再加入已标定好的四单位病毒液25μL毫升，第十一孔为红细胞对照孔，不加病毒液。置振荡器上振荡1-2分钟。（有人习惯此时静置15分钟，个人经验对结果影响不大）
（5）每孔再加入0.7％红细胞悬浮液0.05毫升，放振荡器上振荡l-2分钟，置18-22℃，30-60分后判定结果。
⑥ 第十一孔为红细胞对照孔，第十二孔作为抗原对照孔。
  HI试验与结果
孔号 1    2    3    4    5    6    7    8    9    10    11    12
被检血清
稀释倍数                                                                红细胞  抗原
1:2 1:4 1:8 1:16  1:32  1:64  1:128  1:256  1:512 1:1024  对照对照
稀释液
被检血清 25 25 25    25 25 25 25    25    25    25    50    25
25 25 25    25 25 25 25    25    25    25 弃去
稀释液
标准阳性血清 25 25 25    25 25 25 25    25    25    25    50    25
25 25 25    25 25 25 25    25    25    25 弃去
4单位病毒 25 25 25    25 25 25 25    25    25    25          25
作用时间
与温度振荡1-2min
红细胞悬液 25 25 25    25 25 25 25    25    25    25    25    25
作用时间
与温度振荡1-2min，静置30-60 min
结果1 — — — — — — ++    +++ +++ +++    — +++
结果2 — — — — — — —    —    — +++    — +++

5、结果观察：将反应板倾斜成45℃角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
   能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(log2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：64或HI效价为6(log2)。第十一孔仅含稀释液和红细胞为不凝集对照孔，第十二孔含稀释液，病毒液和红细胞为凝集对照孔。
注意：此处读数时，由于被检卵黄抗体已经预先做了2倍稀释，所以测卵黄抗体是的读数第一孔就不能是1(log2)，而应该是2(log2)，第二孔为3(log2)，以此类推，每孔比血清抗体读数多1.
6、影响结果的因素：根据实际操作中遇到的情况发现影响血凝及血凝抑制试验的因素主要有以下几点：1，试验温度，2，4倍抗原存放条件。3，PBS液的PH值。4，红血球悬液的配制。5，血液样品的采集。6，抗原抗体的反应时间。7，抗原反复冻融次数。
         分析
         1，实验反应温度直接影响实验结果的时间。按照国家标准要求室温。夏天温度高，必须在有空调的实验室进行试验，温度过高，按照标准反应30分钟抗原很容易失效，导致实验失败。
         2，4倍抗原存放条件，配好的4倍抗原一般需要现用现配，冬天无需特殊存放，夏季气温高，抗原易失效，需特殊保存。如检验样品多，抗原添加时间长最好放在冰块上，以免抗原失效，导致后面的实验失败。
         3，PBS液的PH值对实验结果也有影响，按照实验标准PBS液的PH值要求在7.2---7.4之间，PBS液的PH值低，影响鸡的红细胞悬液和抗原的保存，直接影响实验结果。
         4，红细胞悬液要求现用现配，按照标准最好三只未免健康青年公鸡的红细胞悬液；根据实际情况及对比试验，配制好的红细胞开始破裂变形，严重影响实验结果，不能使用。
         5，血液样品的采集，在实际检测中经常遇到同一批鸡两次复检结果不一致，可能跟养殖户采血时间有关。按照血液采集标准，动物在采集血液样品前需禁食8小时，采食前和采食后血液浓稠度不一样，抗体水平肯定有差异。
         6，抗原抗体反应时间也直接影响实验结果，尤其是夏天，反应时间过长，4倍抗原直接失效，导致实验结果失败，即使在有空调的房间抗原抗体反应10--15分钟即可，时间长抗原易失效，影响实验结果，冬天可按照实验标准反应30分钟。
         7，抗原反复冻融次数影响抗原效价。也会影响监测结果，新抗原效价可能是1：512，反复冻融几次可能就将为1：256或更低，所以每次4倍抗原之前检测抗原效价，根据效价才能准确配制4倍抗原。